Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về xylanase từ các chủng vi sinh vật. Nguyễn Thị Uyên Thảo và cộng sự (2004) đã nghiên cứu về việc sử dụng vi nấm
Trichoderma để thu nhận các enzyme cellulose, xylanase và pectinase từ nguồn nguyên liệu bã khoai mì. Tổ hợp enzyme này được nghiên cứu, ứng dụng vào sản xuất thức ăn chăn nuôi [4].
Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2009) ghiên cứu và đánh giá một số tính chất hóa lý của chủng Aspergillus niger DSM1957 trên dịch tinh sạch sơ bộ. Hoạt tính của enzym xylanase đạt cao nhất ở nhiệt độ 55oC, pH là 5,0. Hoạt tính xylanase bị giảm khi ủ với một số ion kim loại (Fe2+, Fe3+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, K+, EDTA) ở nồng độ 2 mM [7].
Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp. Năm 2009, Nguyễn Thị Thu Thùy và cộng sự đã biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý của xylanase tái tổ hợp từ A. oryzae VTCC F187 trong Pichia pastoris GS115 [5]. Khi nghiên cứu biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý của xynalase tái tổ hợp từ chủng
Asprgillus niger DSM1957 trong Pichia pastoris GS115. Hoạt tính xynalase tái tổ hợp cao nhất là 125 U/mg protein. Nhiệt độ và pH tối ưu là 40o
C và pH 4,0. Hoạt tính xynalase vẫn còn duy trì được hơn 70% sau khi ủ 1h ở pH 4,0 – 5,0 và 40oC [8].
Lê Văn Trường, Thomas Schweder (2010) đã biểu hiện gen mã hóa xylanase trong B. subtilis sử dụng promoter α-amylase từ B. amyloliquefaciens. Sau khi biểu hiện, hàm lượng XynA tái tổ hợp được tiết ra môi trường ngoại bào với mức độ cao, đạt khoảng 0,5 mg/ml trên môi trường BMM. Nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu tương ứng là 50oC và pH 6,0 [6].
CHƢƠNG II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Chủng giống
Chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp được cung cấp bởi phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học. Chủng được tạo ra bằng sử dụng đoạn gene mã hóa sinh tổng hợp xylanase G2 từ A. oryzae VTCCF187 có kích thước 699 bp mã hóa cho 232 acid amin được nhân dòng, phân tích trình tự và đăng ký trên gene bank với mã số E4848307. Gen được chèn vào vector biểu hiện pAN7.1GluA, với cặp mồi đặc hiệu có điểm cắt enzyme giới hạn BamHI, plasmid tái tổ hợp được đưa vào
A. niger VTCC017
Chủng A. oryzae VTCC F187, A. niger VTCC 017 được cung cấp từ Trung tâm bảo tồn chủng giống VTCC, Đại học quốc gia Hà Nội. Chủng A. oryzae VTCC F187 được lên men trong môi trường tối ưu bảo gồm 7% bột lõi ngô, 5% bội đậu tương, pH 7,0 [30].
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng đều đạt tiêu chuẩn phân tích, được liệt kê ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng
Tên hóa chất Hãng sản xuất (nƣớc)
3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) Honeywell Fluka (Mỹ)
Acrylamide Bio Basic Canada Inc (Canada)
Albumin Mti-Diagnostics GmbH (Đức)
Amoni persulfate Sigma (Mỹ)
Sodium metabisulfite Bio Basic Canada Inc (Canada) Bis-acrylamid ICN Biomedicals (Mỹ)
Brommophenol blue Sigma (Mỹ)
Cao nấm men Bio Basic Canada Inc (Canada) Coomassie brilliant blue Sigma (Trung Quốc)
DEAE Heldelberg (Đức)
Mercapthoethanol Sigma (Mỹ)
SDS Sigma (Mỹ)
Tris Bio Basic Canada Inc (Canada) Xylan from birchwood Biochemika
D-Xylose Sigma (Nhật Bản)
L- arabinose, Arabinoxylan Megazyme
Arabinoxylan Trường ĐHKH tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, Việt Nam
Và một số hóa chất thông dụng khác.
Bột đậu tương, bột lõi ngô đều đạt tiêu chuẩn của nhà sản xuất tại Việt Nam. Các dung dịch và đệm sử dụng được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2: Thành phần các loại đệm và dung dịch
Dung dịch Thành phần, nồng độ
Bradford stock solution 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva blue G; 200 ml 88% phosphoric acid
Bradford working buffer 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric acid; 30 ml Bradford stock solution Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl; pH 8,8
Dung dịch APS 20% amoni persulfat
Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8
Dung dịch C 30% acrylamid; 0,8% bis-acrylamid Dung dịch D 10% SDS (tinh thể); 25 mM EDTA Dung dịch DNS
(1000ml)
153 g KNaC4H4O6.4H2O; 4,15g Na2S2O5; 5,3 g DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol (làm tan ở 50oC)
Dung dịch nhuộm 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch tẩy PAGE 60% (v/v) H2O; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic
Đệm potasium phosphat 20 mM K2HPO4; pH 6,5
Đệm điện di protein (biến tính) 20 mM Tris-HCl; 192 mM glycerin; 0,1% (w/v) SDS; pH 8,4
Đệm tra mẫu protein 5X (biến tính)
0,05% brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10% SDS; 10% β-mercaptho-ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch cơ chất 0,5% xylan, pha trong đệm 20 mM potasium phosphat pH 6,5
Dung dịch đặc cơ chất 0,5% xylan; 1,2% agar Dung dịch Native purification
buffer (NPB) 5X
250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl pH 8,0
Dung dịch Native purification buffer (NPB) 1X
80% H2O; 20% 5x native purification buffer (NPB)
Dung dịch Native binding buffer (NBB)
250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl và 10 mM imidazole pH 8,0
Dung dịch Native wash buffer (NWB)
250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl và 20 mM imidazole pH 8,0
Dung dịch Native elution buffer (NEB)
250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl và 250 mM imidazole pH 8,0
Các hóa chất thông thường khác: NaOH, HCl, ethanol, nước khử RO. Các hóa chất này đều đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.1.3. Môi trƣờng
Môi trường YP gồm: 1% (w/v) yeast extract; 2% (w/v) peptone.
Môi trường YPG bao gồm: 1% (w/v) yeast extract; 2% (w/v) peptone; 2% (w/v) D-glucose.
Môi trường YPGS bao gồm: 1% (w/v) yeast extract; 2% (w/v) peptone; 2% (w/v) D-glucose, 1 M sorbitol.
Môi trường nuôi cấy: 7% bột lõi ngô, 5% bội đậu tương, pH 7,0 được khử trùng.
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học được liệt kê ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng
Tên thiết bị Xuất xứ
Bể ổn nhiệt VS-1205CW Vision (Hàn Quốc)
Box cấy vi sinh vật clean bench TTCG Công nghệ (Việt Nam)
Máy đo pH-827 Metrohm (Thụy Sỹ)
Máy lắc rung ổn nhiệt ProvocellTM Esco (Mỹ)
Máy lắc rung Inka (Đức)
Máy li tâm lạnh Hitachi (Nhật)
Máy khuấy từ Metrohm (Thụy Sỹ)
Hệ thống điện di đứng Biorad (Mỹ)
Máy quang phổ UV 2500 Labomed (Mỹ)
Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật)
Tủ lạnh 4oC, - 20oC Toshiba (Nhật)
Dụng cụ thí nghiệm
Các ống ly tâm eppendorf 2,0 ml; 1,5 ml; 0,5 ml. Các ống falcon 15 ml; 50 ml.
Micropipet và đầu côn phù hợp với các thể tích 0,5 - 10 µL; 10 - 100 µL; 20- 200 µL; 100 - 1000 µL.
Dụng cụ thủy tinh: đĩa Petri, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, nhiệt kế, ống đong, chai đựng hóa chất.
Dụng cụ nhựa khác: hộp đựng mẫu, giá để ống. Các dụng cụ đều đạt chuẩn phân tích.
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase
Đối với chủng tự nhiên: Chủng nấm A. oryzae VTCCF187 sinh tổng hợp xylanase được hoạt hóa, nhân giống trong môi trường Czapek nhiệt độ 30C, lắc 180 vòng/phút sau 72 giờ. Sau đó được nuôi trong môi trường nuôi cấy chứa 7% bột lõi ngô, 5% bội đậu tương, pH 7,0 ở 28C, lắc 180 vòng/phút sau 168 giờ [29].
Đối với chủng tái tổ hợp: Chủng nấm A. niger VTCC017/pANXlnG2 sinh tổng hợp xylanase được hoạt hóa, nhân giống trong môi trường YPG nhiệt độ 30oC, lắc 180 vòng/phút sau 72 giờ. Sau đó được nuôi trong môi trường YP cảm ứng hygromycin, lắc 200 vòng/phút, thời gian lên men 72 giờ [29].
2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xylanase
2.2.2.1. Định tính xylanase
Xylanase được định tính theo phương pháp khuếch tán enzym trên đĩa thạch [2].
Nguyên tắc:
Dựa vào khả năng thủy phân xylan của xylanase. Hoạt tính enzym được đánh giá theo bán kính vòng sáng do xylanase thủy phân xylan 0,5% tạo ra.
Tiến hành:
Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất xylan trong nước cất dày khoảng 0,5 cm, được đục lỗ đường kính 0,5 cm. 100 μl dịch enzym được cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4o
C cho enzym khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch được ủ 6 giờ ở 37oC lấy ra và nhuộm bằng lugol 1%. Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tương đối của enzym.
2.2.2.2. Định lượng xylanase
Hoạt tính xylanase được định lượng theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) [60].
Nguyên tắc:
Dịch enzym phản ứng với cơ chất xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở trong điều kiện pH, nhiệt độ và khoảng thời gian phản ứng là 5 phút. Hàm lượng đường khử giải phóng ra được định lượng bằng phản ứng với DNS và đo quang phổ bước sóng 540 nm. Độ hấp thụ được đối chiếu với đường chuẩn nồng độ đường xylose để tính hàm lượng đường giải phóng tương đương. Từ đó tính ra hoạt độ enzym.
Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ xylanase là lượng enzym phân giải cơ chất xylan thành đường khử tương đương 1 µmol xylose trong một phút ở điều kiện nhất định [60].
Tiến hành:
Xây dựng đường chuẩn: xylose được pha trong 100 mM đệm natri acetat pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 10-70 µg/ml. Tiến hành phản ứng với DNS và đo độ hấp thụ ở 540 nm. Độ hấp phụ và nồng độ xylose được vẽ theo chương trình Excel. Kết quả cho thấy, đuờng nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 10-70 µg/ml. Đường chuẩn có phương trình y = 0,0178x + 0,0312. Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 540 nm, x là nồng độ xylose (µg/ml) (Hình 2.1).
Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzym 0,4 ml được cho vào ống nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% xylan pha trong 20 mM đệm potasium phosphat pH 6,5. Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50oC, sau đó bổ sung ngay 1,25 ml DNS. Lắc đều hỗn hợp và đun cách thủy 5 phút. Sau đó, dịch được làm nguội và đo OD ở bước sóng 540 nm. Lặp lại 3 lần.
Ống kiểm tra: Hút 0,1 ml dịch enzyme, thêm 1,25 ml DNS, ủ 5 phút. Sau đó bổ sung 0,4 ml dung dịch 0,5% xylan pha trong 20 mM đệm potasium phosphat pH 6,5.
Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50oC. Sau đó đun cách thủy 5 phút. Dịch được làm nguội và đo OD ở bước sóng 540 nm.
Hình 2.1: Đƣờng chuẩn xylose
2.2.3. Xác định hàm lƣợng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [20].
Nguyên lý:
Các protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ protein. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò.
Tiến hành:
Dựng đường chuẩn: albumin huyết thanh bò (BSA) được pha trong nước muối sinh lý NaCl 0,9% với dải nồng độ 2,5-30 µg/ml. Cho 900 µl dung dịch Bradford working phản ứng với 100 µl dung dịch BSA chuẩn. Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Kết quả đường chuẩn
protein có phương trình y = 0,0031x + 0,1298 với y là độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm, x là nồng độ BSA (µg/ml) (Hình 2.2).
Hình 2.2: Đƣờng chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn
Ống thí nghiệm: Cho 900 µl dung dịch Bradford working phản ứng với 100 µl dung dịch protein. Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Lặp lại 3 lần.
Ống trắng: Cho 900 µl dung dịch bradford working phản ứng với 100 µl dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%. Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.
2.2.4. Tinh sạch xylanase
Đối với chủng tái tổ hợp:
Quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger tái tổ hợp được mô tả tóm tắt trong hình 2.3
Dịch enzym thô
Ly tâm 10000 vòng/phút,10 phút
Qua cột PronondTM
Enzym xylanase tinh sạch
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger
tái tổ hợp
Đối với chủng tự nhiên:
Dịch enzym thô
Ly tâm 10000 vòng/phút,10 phút
Qua cột sắc ký lọc gel (Sephadex G200)
Qua cột sắc ký trao đổi ion (DEAE-sephadex)
Enzym xylanase tinh sạch
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase từ chủng A. oryzae
tự nhiên
2.2.4.1. Tinh sạch xylanase tái tổ hợp bằng cột ProbondTM
Protein tái tổ hợp được tinh sạch sử dụng kit tinh sạch ProbondTM (Invitrogen). Cột tinh sạch 10ml theo kit được cho 2 ml resin vào, resin lắng xuống nhờ trọng lực và
hút nhẹ dịch nổi ra. Cột Ni2+ được rửa 2x với nước khử ion và đệm gắn cột (NBB) pH 8,0. Sau đó hút 9 ml protein (dịch nổi) cần tinh sạch đưa lên cột, đặt lên máy lắc rung nhẹ để các hạt resin luôn giữ ở trạng thái lơ lửng trong dịch protein 30-60 phút để xynalase gắn vào hạt resin. Tiếp theo, các hạt resin được để lắng và loại bỏ dịch trong cột. Cột được rửa 3x với đệm rửa (NWB) pH 8,0. Protein gắn cột được thôi ra bằng dung dịch (NEB) pH 8,0 với 11 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Hàm lượng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.
2.2.4.2. Tinh sạch xylanase tự nhiên
Tinh sạch xylanase bằng cột sắc ký Sephadex G-200
Đầu tiên, xylanase được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.
Nguyên lý:
Sắc ký lọc gel sẽ tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước và khối lượng các phân tử. Gel (các hạt hình cầu) nhồi vào cột tạo thành mạng lưới lỗ xốp. Khi hỗn hợp mẫu được nạp vào cột, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào các lỗ. Còn các phân tử kích thước lớn sẽ khó vào lỗ hơn, tiếp tục đi dọc theo cột; do đó, sẽ được rửa giải ra khỏi cột sớm hơn những phân tử nhỏ [31].
Tiến hành:
Dịch enzym thô (dịch lên men) sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi và đưa dịch nổi lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-200. Kích thước cột là 0,6 x 26 cm, được cân bằng với đệm kali phosphat 50 mM, pH 7,5. Tốc độ dòng chảy khoảng 25 ml/h. Thu thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzym được xác định trong mỗi phân đoạn.
Tinh sạch xylanase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex
Sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel, bước tiếp theo, xylanase được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex [25, 30].
Ở pH khác pI của protein, protein mang điện tích. Cho hỗn hợp protein chảy qua cột sắc ký chứa pha tĩnh (Diethylaminoethyl) là các hạt tích điện dương được gắn trong mạng lưới gel Sephadex. Các protein mang điện âm sẽ liên kết với pha tĩnh bằng lực ion mạnh hơn các protein mang điện dương. Hỗn hợp mẫu chất đang gắn vào pha tĩnh trong dung dịch đệm có nồng độ ion thấp. Pha động chạy qua cột có nồng độ ion lớn (nồng độ NaCl cao) sẽ cạnh tranh gắn pha tĩnh với protein, đẩy protein ra khỏi pha tĩnh, theo dòng chảy ra khỏi cột. Tùy thuộc vào điện tích mỗi protein mà lực ion mạnh yếu khác nhau, từ đó các protein sẽ được rửa giải ra khỏi cột ở những điểm khác nhau theo gradient nồng độ NaCl. Protein mang điện dương sẽ được rửa giải ra trước [25].
Tiến hành:
Các phân đoạn qua cột Sephadex G200 có hoạt tính xylanase cao nhất được đưa lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE-Sephadex. Cột có kích thước 0,6 x 26 cm được cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 chứa 50 mM NaCl.Tốc độ dòng chảy khoảng 24 ml/h. Thu mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 chứa NaCl với nồng độ NaCl tăng dần 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M và 1 M; sử dụng 10 ml đệm để thôi mẫu ứng với mỗi nồng độ. Thu thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzym được xác định trong mỗi phân đoạn.
2.2.5. Điện di SDS-PAGE
Gel polyacrylamid được sử dụng để điện di protein với nồng độ 12,5% theo phương pháp điện di biến tính của Laemmli (2011) [40].
Nguyên lý:
Các phân tử protein trong môi trường có SDS sẽ bị duỗi thẳng và tích điện âm, vì vậy sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng.
Tiến hành: gồm 3 bước.