Thành phần Gel tách (µl) Gel cô (µl)
H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015
Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm xử lý mẫu dye 5x với tỷ lệ mẫu/dye là 5/1, biến tính ở 95oC trong 10 phút, sau đó để ở tủ -20 oC trong 1 phút
Điện di: Bản điện di được lắp vào hệ thống điện di, cường độ dòng điện 20 mA cho lớp gel cô và 35 mA cho lớp gel tách đến khi hàng mẫu chạy xuống đáy bản gel. Sau đó bản gel được tách khỏi phiến kính, nhuộm bằng dung dịch nhuộm PAGE trong 1,5-2 giờ. Bản gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy PAGE trong khoảng 2 giờ.
2.2.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase
2.2.6.1. Nhiệt độ phản ứng tối thích
Phản ứng của dịch enzyme tinh sạch và cơ chất 0,5% xylan trong đệm potassium phosphat 20 mM, pH 6,5 được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 37 - 80oC. Hoạt tính xylanase được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với thời gian ủ là thời gian phản ứng tối ưu.
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các đệm potasium phosphat 20 mM có pH khác nhau từ 3,5-8,0, sau đó tiến hành xác định hoạt tính theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959), với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, pH 6,5 ở nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
2.2.6.3. Xác định độ bền nhiệt độ
Dịch enzym tinh sạch được ủ từ 1, 5 và 24 giờ ở các nhiệt độ khác nhau từ 25, 37, 40, 50oC. Dịch enzym sau khi ủ được xác định hoạt tính theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959), với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ tối ưu.
2.2.6.4. Xác định độ bền pH
Dịch enzym tinh sạch được ủ với đệm potasium phosphat có nồng độ 20 mM với các pH khác nhau từ 4,0-8,0 sau các khoảng thời gian từ 1, 2, 8 và 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ tối ưu.
2.2.6.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các chất Tween 80, Tween 20, Trixton x100, SDS ở nồng độ 2% trong 1 giờ. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
2.3.5.6. Ảnh hưởng của các dung môi
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các dung môi: Methanol, ethanol, acetone, isopropanol, n-butanol trong 1 giờ. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các ion kim loại: Mg2+, Fe2+, Cu2+, Ca2+, Ag+, Ni+, K+, EDTA, Zn+, Hg+ với nồng độ 10 mM trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
2.2.6.8. Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase
Sử dụng cùng số đơn vị hoạt độ (khoảng 1 U cho 1 mg mẫu araninoxylan) của mỗi một loại enzyme xylanase để thủy phân arabinoxylan trong 24 giờ ở 55οC, trong đệm CH3COONa 50 mM, pH 5. Dịch mẫu sau khi thủy phân được bất hoạt enzyme ở 100oC trong 10 phút.
2.2.6.9. Thủy phân cơ chất bằng enzyme xylanase
Cơ chất: Bột đậu tương, bột cám gạo, bột lõi ngô, bột bã mía, bột gỗ mục, Xylan. Pha 5 g bột cơ chất với 40ml đệm phosphate 20 mM, pH 6,5. Trộn 1000 μl cơ chất với 200μl enzyme, ủ ở 55οC, tại mỗi thời điểm 15-30-60-90 phút 250 μl dung dịch đun cách thủy 10 phút để dừng phải ứng. Sau đó li tâm 10000v/ phút trong 10 phút. Rồi thu dịch chấm sắc kí (10 μl).
2.2.6.10. Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC Nguyên tắc:
Sắc ký bản mỏng bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính hoặc nhôm, là pha cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra sự phân tách các chất chấm trên bản gel. Do các chất di chuyển với tốc độ nhanh chậm khác nhau nên chúng dần dần được tách ra khỏi nhau dưới dạng các vết trên bản mỏng. Để đánh giá khả năng phân tách của từng chất trên bản sắc ký người ta quan tâm đến giá trị Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất trong hệ thống sắc ký, được tính bằng tỉ số giữa khoảng cách mà chất đó di chuyển được khỏi vệt xuất phát trên khoảng cách mà dung môi di chuyển được.
Rf = Trong đó:
a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử
b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến vạch mức cuối cùng mà dung môi chạy đến Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký có thể được hiển thị bằng các
phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn. Khi việc phân tách các chất trong hỗn hợp không rõ ràng, người ta có thể thay đổi thành phần và/ hoặc tỷ lệ của các dung môi trong hỗn hợp dung môi sắc ký. Việc bổ sung các chất không phân cực cũng như tăng tỷ lệ của chúng sẽ tạo điều kiện cho các chất ít phân cực chạy nhanh hơn khỏi vạch xuất phát và ngược lại [3].
Tiến hành:
Dùng pipet loại nhỏ hoặc dùng ống chấm sắc ký có chia vạch thể tích (5-10 μl) để hút mẫu và chấm lên các vị trí đã được đánh dấu trên bản gel. Bản gel sau khi chấm mẫu được đặt vào hệ thống bình sắc ký có nắp đậy, trong đó có chứa dung môi hữu cơ. Mức dung môi luôn được giữ thấp hơn vạch xuất phát của mẫu. Dung môi sẽ theo lớp gel để chạy ngược lên và mang theo các chất cần phân tích. Khi vạch dung môi chạy đến gần mép trên của bản gel sắc ký thì phải làm ngừng quá trình sắc ký. Bản gel được lấy ra, làm khô dung môi và sau đó có thể cho chạy lại một vài lần tương tự, tùy thuộc vào sự tách bạch giữa các mẫu quan tâm [3]. Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký được hiển thị bằng phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn là D-xylose và L-arabinose được mua từ hãng Megazyme.
2.2.7 Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm MS excel 2016 và GraphPad Prism 8.1.0. Các giá trị được biểu diễn dưới dạng X ± SD (X là giá trị trung bình).
Hoạt tính riêng (IU/mgprotein) = Hoạt tính (IU/ml): Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính tổng (IU) = Hoạt tính (IU/ml) x Thể tích (ml)
Độ sạch (lần) = Hoạt tính riêng (mẫu): Hoạt tính riêng (dịch nổi lên men) Hiệu suất tinh sạch (%) = Hoạt tính tổng (mẫu) x 100%: Hoạt tính tổng (dịch nổi lên men).
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nuôi biểu hiện và tinh sạch enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp sinh tổng hợp xylanase hợp xylanase
Chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 được tiến hành nuôi biểu hiện trong môi trường YPG, cảm ứng hygromycin. Sau 72 giờ nuôi biểu hiện, dịch nổi được điện di trên gel polyacrylamide 12,5%. Kết quả trên hình 3.1A cho thấy dịch nổi chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 xuất hiện một băng protein có khối lượng phân tử <25 kDa (làn 2 - hình 3.1A), trong khi đó chủng tự nhiên A. niger VTCCF017 không xuất hiện (làn 1- hình 3.1A và làn 1 – hình 3.1B)
A B C
Hình 3.1: Điện di đồ protein tổng số của các mẫu protein và hoạt tính xylanase tái tổ hợp trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất xylan 0,5%
Ghi chú:
(A) mẫu biểu hiện chủng A. niger VTCC 017/pANXlnG2 tái tổ hợp (1) chủng A. niger VTCC 017 tự nhiên; (2) chủng A. niger VTCC 017/pANXlnG2 tái tổ hợp; (M) marker protein; (B) (1) mẫu protein tự nhiên từ chủng A. niger VTCC 017; 2: Phân đoạn qua cột sephadex G200 của chủng A. oryzae VTCC F187 (3) chủng A. oryzae VTCC F187; (M) marker protein; (C) hoạt tính của enzyme xynalase từ chủng A. niger tái tổ hợp trên đĩa thạch: ĐC: H2O; 1-5: mẫu enzyme xylanase tái tổ hợp
ĐC
1 2
3 4 5
Hoạt tính xylanase của chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp thể hiện hoạt tính thủy phân 0,5% cơ chất xylan trên đĩa thạch (hình 3.1C) và đạt 105 IU/ml so với chủng tự nhiên A. oryzae VTCC-F187 đạt 114 IU/ml. Theo một số nghiên cứu trên thế giới khi biểu hiện enzyme ở các chủng khác nhau thì hoạt tính xylanase thu được là khác nhau. Biểu hiện xylanase từ A. usamii trong E. coli BL21 (DE3) hoạt tính enzyme đạt 49,6 IU/ml [88]. Biểu hiện enzyme xylanase G2 trong pichia pastoris hoạt tính đạt 41 IU/ml [5]. Như vậy, khi biểu hiện trong A. niger hoạt tính enzyme xylanase đã được cải thiện tăng đạt 105 IU/ml so với các hệ biểu hiện khác.
A B
Hình 3.2: Hình ảnh hoạt tính enzyme xylanase từ (A) chủng tự nhiên A. oryzae
VTCC-F187; (B) chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp
(ĐC: Đối chứng, M: Mẫu thí nghiệm) 3.2. Tinh sạch enzyme xylanase tái tổ hợp
Dòng tế bào A. niger VTCC017/pANXlnG2 được nuôi với lượng lớn 200 ml và thu hoạch sau 72 giờ cảm ứng bằng hygromycin. Dịch nuôi được ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút để loại tủa tế bào. Dịch trong chứa protein được đưa lên cột để tinh sạch theo phương pháp đã mô tả (Hình 2.3). Xylanase tái tổ hợp được gắn đuôi 6xhistidin để tinh sạch dễ dàng và hiệu quả cao. Xylanase tái tổ hợp tinh sạch qua cột ProBondTM resin (Invitrogen) và được kiểm tra trên gel SDS-PAGE.
Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch sau khi qua cột histag xylanase G2
Ghi chú: (1) Dịch nổi chủng tái tổ hợp; (2-5) các phân đoạn xylanase TTH tinh sạch;
(M) thang protein chuẩn
Các phân đoạn tinh sạch chỉ có một băng protein xuất hiện ở dạng đồng nhất trên điện di đồ (Hình 3.3) và có kích thước khoảng 23 kDa tương ứng với kích thước của xylanase tái tổ hợp, với hoạt tính đạt 1102 IU/ml protein, thấp hơn so với hoạt tính riêng của xylanase tự nhiên từ chủng A. oryzae VTCC F187 (6768 U/mgprotein). Biểu hiện thành công Xyl B trong pichia pastoris GS115 có kích thước 27 kDa [8]. Bên cạnh đó, biểu hiện Xyl G2 trong pichia pastoris với kích thước 27 KDa [5]. Dịch nổi
A. niger VTCC017/pANXlnG2 cũng có băng protein với kích thước tương đương và nhiều protein khác nữa của tế bào A. oryzae VTCC F187 với các trọng lượng phân tử khác nhau (Hình 3.1, làn 2).Để xác định độ tinh sạch của enzyme tái tổ hợp, hàm lượng protein trong các dịch mẫu ở các bước tinh sạch được xác định theo phương pháp Bradford, và xác định hoạt tính theo Miller và cộng sự (1954). Từ 8 ml dịch thô ban đầu của chủng tái tổ hợp A. niger VTCC017/pANXlnG2 thu được 501,1 IU/mg protein. Xylanase G2 được tinh sạch với 4 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1,0 ml. Protein tinh sạch đạt 1102,5 IU/mg protein tương ứng với hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp là 52,6, độ sạch 2,2 lần.
Bảng 3.1: Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger VTCC017/ pANXlG2 Mẫu Hoạt tính tổng (IU) Protein tổng (mg) Hoạt tính
riêng (IU/mg) Độ sạch Hiệu suất
thu hồi (%)
Dịch nổi 922,1 1,84 501,1 1 100
Dịch tinh sạch
485,1 0,44 1102,5 2,2 52,6
3.3. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme xylanase tái tổ hợp 3.3.1. Nhiệt độ tối ƣu và độ bền nhiệt độ
Khi tăng nhiệt độ phản ứng từ 37oC lên 55oC thì hoạt tính xylanase cũng tăng dần từ 56% lên 100%, hoạt tính enzyme đạt cao nhất ở 55oC (1058,9 IU/mg). Khi nhiệt độ phản ứng tiếp tục tăng trên nhiệt độ tối ưu 55oC thì hoạt tính còn lại theo chiều hướng giảm dần. Nhiệt độ phản ứng tối ưu cho xyalanse tái tổ hợp là 55oC (Hình 3.4A).
A B
Hình 3.4: Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase tái tổ hợp
Mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian ủ enzyme. Hoạt tính của enzyme ủ ở các nhiệt độ 25C, 37C, 40C và 50C theo thời gian khá gần nhau (Hình 3.4B), đều giảm theo thời gian, nhưng nhiệt độ ủ càng cao, hoạt tính càng giảm nhiều. Sau 5 giờ ủ ở 25C-50C, hoạt tính enzyme giảm còn 53% đến 92%, sau 24 giờ ủ, ở 50C hoạt tính giảm còn 53% so với hoạt tính ban đầu (Hình 3.4B).
3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH
Ở pH 3,5 hoạt tính tương đối của xylanase là 35,4% (Hình 3.5). Khi pH phản ứng tăng tới 6,5 (852,3 IU/mg) thì đạt cực đại. độ pH tiếp tục tăng lên thì hoạt tính còn lại giảm đều xuống còn 69,3% ở pH 8. Vậy xylanase tái tổ hợp tối ưu trong môi trường trung tính (Hình 3.5A).
pH môi trường ảnh hưởng đến độ bền của protein enzyme nên việc lựa chọn môi trường có đệm pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Đệm potassium phosphate được chọn tiếp tục để khảo sát độ bền xylanase với các pH khác nhau 4,0- 8,0 ở nhiệt độ phòng (Hình 3.5B). Xylanase từ chủng tái tổ hợp tương đối bền ở pH 4,0, sau 24 giờ ủ, hoạt tính vẫn còn 78% ở pH 4,0 và 79% ở pH 8,0 (Hình 3.5B).
Như vậy, từ kết quả nghiên cứu đánh giá: Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ, ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH cho thấy: Xylanase G2 hoạt động tối ưu ở
A B
Hình 3.5: Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase tái tổ hợp
nhiệt độ 55oC, pH 6,5. Enzyme tái tổ hợp bền ở dải nhiệt độ và pH; 25 - 40oC, pH 4 - 8. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới như: Nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch enzyme Xyl G2 và Xyl F3 là hai họ xylanase từ A. oryzae. Kết quả cho thấy hoạt tính Xyl G2 tinh sạch đạt tối ưu ở pH 6,0, nhiệt độ 58oC. Gen mã hóa Xyl F3 có kích thước 1468 bp mã hóa cho 323 amino acid, nhiệt độ tối ưu của enzyme xylanase tái tổ hợp là 58oC, pH 5,0 [45, 46]. Bên cạnh đó, gen được nhân dòng Xyl B có kích thước 678 bp mã hóa sinh tổng hợp 225 aa, Xyl B có khối lượng 21 KDa, nhiệt độ và pH tối ưu là 55oC, pH 5,0 [49].
3.3.3. Dung môi hữu cơ
Các dung môi hữu cơ đều làm ảnh hưởng đến hoạt tính xylanase. Ethanol, acetone, Isopropanol với nồng độ 30% (v/v) sau 2 giờ ủ ở nhiệt độ phòng đều làm giảm mạnh hoạt tính của xylanase còn 41% đến 72% hoạt tính, riêng methanol 30% (v/v) làm giảm nhẹ hoạt tính của xylanase còn 85% (Hình 3.6).
Hình 3.6: Ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ hữu cơ methanol (MtOH), ethanol (EtOH), acetone (Act), isopropanol (IsOH) và n-butanol (n-BtOH) lên hoạt tính
xylanase tái tổ hợp, ĐC (mẫu đối chứng)
Như vậy, trong tất cả các dung môi khảo sát ảnh hưởng tới hoạt tính của xylanase tái tổ hợp thì tất cả các dung môi ở nồng độ 30% đều làm giảm hoạt tính
enzyme, riêng dung môi methanol ở nồng độ 30% làm giảm nhẹ hoạt tính enzyme hơn so với các dung môi: ethanol, isopropanol, acetone, n-butanol. N-butanol làm giảm hoạt tính enzyme mạnh nhất. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thu Thùy và cộng sự (2009), hoạt tính xylanase G2 ít ảnh hưởng bởi các dung môi methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol và acetone ở nồng độ thấp 2%, với nồng độ cao hơn như: 10% và 20% thì đều làm giảm hoạt tính của enzyme hơn so với mẫu đối chứng [5]. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên xylanase từ chủng tự nhiên A. oryzae DMS1863 cho thấy n-butanol làm tăng hoạt tính lên tới còn acetone làm giảm hoạt tính xuống còn 31% [9].
3.3.4. Chất tẩy rửa
Các chất tẩy rửa như Tween 20, SDS có ảnh hưởng đến hoạt tính xylanase. ở nồng độ Tween 20 2% (v/v), SDS 2% (v/v) hoạt tính tương đối giảm tương ứng từ 100% xuống còn 73% và 49% sau 2 giờ ủ. Riêng với Triton X-100 và Tween 80 làm tăng mạnh hoạt tính xylanase đạt từ 103% đến 117% (Bảng 3.2). Chủng A. oryzae
DMS1863 cho thấy ở nồng độ thấp (0,2 – 1%), Tween 20 và Triton X-100 hầu như không ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính xylanase. Hoạt tính xylanase lại giảm một cách rõ rệt ở nồng độ cao 2%. Trong khi đó, SDS làm giảm hoạt tính enzyme mạnh nhất ở tất cả các nồng độ [9].
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp
Chất tẩy rửa Hoạt tính xylanase còn lại (%)
Đối chứng 100±0,00
Trixton X-100 103±5,6
Tween 80 117±0,7