Ghi chú: (1) Dịch nổi chủng tái tổ hợp; (2-5) các phân đoạn xylanase TTH tinh sạch;
(M) thang protein chuẩn
Các phân đoạn tinh sạch chỉ có một băng protein xuất hiện ở dạng đồng nhất trên điện di đồ (Hình 3.3) và có kích thước khoảng 23 kDa tương ứng với kích thước của xylanase tái tổ hợp, với hoạt tính đạt 1102 IU/ml protein, thấp hơn so với hoạt tính riêng của xylanase tự nhiên từ chủng A. oryzae VTCC F187 (6768 U/mgprotein). Biểu hiện thành công Xyl B trong pichia pastoris GS115 có kích thước 27 kDa [8]. Bên cạnh đó, biểu hiện Xyl G2 trong pichia pastoris với kích thước 27 KDa [5]. Dịch nổi
A. niger VTCC017/pANXlnG2 cũng có băng protein với kích thước tương đương và nhiều protein khác nữa của tế bào A. oryzae VTCC F187 với các trọng lượng phân tử khác nhau (Hình 3.1, làn 2).Để xác định độ tinh sạch của enzyme tái tổ hợp, hàm lượng protein trong các dịch mẫu ở các bước tinh sạch được xác định theo phương pháp Bradford, và xác định hoạt tính theo Miller và cộng sự (1954). Từ 8 ml dịch thô ban đầu của chủng tái tổ hợp A. niger VTCC017/pANXlnG2 thu được 501,1 IU/mg protein. Xylanase G2 được tinh sạch với 4 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1,0 ml. Protein tinh sạch đạt 1102,5 IU/mg protein tương ứng với hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp là 52,6, độ sạch 2,2 lần.
Bảng 3.1: Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger VTCC017/ pANXlG2 Mẫu Hoạt tính tổng (IU) Protein tổng (mg) Hoạt tính
riêng (IU/mg) Độ sạch Hiệu suất
thu hồi (%)
Dịch nổi 922,1 1,84 501,1 1 100
Dịch tinh sạch
485,1 0,44 1102,5 2,2 52,6
3.3. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme xylanase tái tổ hợp 3.3.1. Nhiệt độ tối ƣu và độ bền nhiệt độ
Khi tăng nhiệt độ phản ứng từ 37oC lên 55oC thì hoạt tính xylanase cũng tăng dần từ 56% lên 100%, hoạt tính enzyme đạt cao nhất ở 55oC (1058,9 IU/mg). Khi nhiệt độ phản ứng tiếp tục tăng trên nhiệt độ tối ưu 55oC thì hoạt tính còn lại theo chiều hướng giảm dần. Nhiệt độ phản ứng tối ưu cho xyalanse tái tổ hợp là 55oC (Hình 3.4A).
A B
Hình 3.4: Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase tái tổ hợp
Mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian ủ enzyme. Hoạt tính của enzyme ủ ở các nhiệt độ 25C, 37C, 40C và 50C theo thời gian khá gần nhau (Hình 3.4B), đều giảm theo thời gian, nhưng nhiệt độ ủ càng cao, hoạt tính càng giảm nhiều. Sau 5 giờ ủ ở 25C-50C, hoạt tính enzyme giảm còn 53% đến 92%, sau 24 giờ ủ, ở 50C hoạt tính giảm còn 53% so với hoạt tính ban đầu (Hình 3.4B).
3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH
Ở pH 3,5 hoạt tính tương đối của xylanase là 35,4% (Hình 3.5). Khi pH phản ứng tăng tới 6,5 (852,3 IU/mg) thì đạt cực đại. độ pH tiếp tục tăng lên thì hoạt tính còn lại giảm đều xuống còn 69,3% ở pH 8. Vậy xylanase tái tổ hợp tối ưu trong môi trường trung tính (Hình 3.5A).
pH môi trường ảnh hưởng đến độ bền của protein enzyme nên việc lựa chọn môi trường có đệm pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Đệm potassium phosphate được chọn tiếp tục để khảo sát độ bền xylanase với các pH khác nhau 4,0- 8,0 ở nhiệt độ phòng (Hình 3.5B). Xylanase từ chủng tái tổ hợp tương đối bền ở pH 4,0, sau 24 giờ ủ, hoạt tính vẫn còn 78% ở pH 4,0 và 79% ở pH 8,0 (Hình 3.5B).
Như vậy, từ kết quả nghiên cứu đánh giá: Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ, ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH cho thấy: Xylanase G2 hoạt động tối ưu ở
A B
Hình 3.5: Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase tái tổ hợp
nhiệt độ 55oC, pH 6,5. Enzyme tái tổ hợp bền ở dải nhiệt độ và pH; 25 - 40oC, pH 4 - 8. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới như: Nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch enzyme Xyl G2 và Xyl F3 là hai họ xylanase từ A. oryzae. Kết quả cho thấy hoạt tính Xyl G2 tinh sạch đạt tối ưu ở pH 6,0, nhiệt độ 58oC. Gen mã hóa Xyl F3 có kích thước 1468 bp mã hóa cho 323 amino acid, nhiệt độ tối ưu của enzyme xylanase tái tổ hợp là 58oC, pH 5,0 [45, 46]. Bên cạnh đó, gen được nhân dòng Xyl B có kích thước 678 bp mã hóa sinh tổng hợp 225 aa, Xyl B có khối lượng 21 KDa, nhiệt độ và pH tối ưu là 55oC, pH 5,0 [49].
3.3.3. Dung môi hữu cơ
Các dung môi hữu cơ đều làm ảnh hưởng đến hoạt tính xylanase. Ethanol, acetone, Isopropanol với nồng độ 30% (v/v) sau 2 giờ ủ ở nhiệt độ phòng đều làm giảm mạnh hoạt tính của xylanase còn 41% đến 72% hoạt tính, riêng methanol 30% (v/v) làm giảm nhẹ hoạt tính của xylanase còn 85% (Hình 3.6).
Hình 3.6: Ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ hữu cơ methanol (MtOH), ethanol (EtOH), acetone (Act), isopropanol (IsOH) và n-butanol (n-BtOH) lên hoạt tính
xylanase tái tổ hợp, ĐC (mẫu đối chứng)
Như vậy, trong tất cả các dung môi khảo sát ảnh hưởng tới hoạt tính của xylanase tái tổ hợp thì tất cả các dung môi ở nồng độ 30% đều làm giảm hoạt tính
enzyme, riêng dung môi methanol ở nồng độ 30% làm giảm nhẹ hoạt tính enzyme hơn so với các dung môi: ethanol, isopropanol, acetone, n-butanol. N-butanol làm giảm hoạt tính enzyme mạnh nhất. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thu Thùy và cộng sự (2009), hoạt tính xylanase G2 ít ảnh hưởng bởi các dung môi methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol và acetone ở nồng độ thấp 2%, với nồng độ cao hơn như: 10% và 20% thì đều làm giảm hoạt tính của enzyme hơn so với mẫu đối chứng [5]. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên xylanase từ chủng tự nhiên A. oryzae DMS1863 cho thấy n-butanol làm tăng hoạt tính lên tới còn acetone làm giảm hoạt tính xuống còn 31% [9].
3.3.4. Chất tẩy rửa
Các chất tẩy rửa như Tween 20, SDS có ảnh hưởng đến hoạt tính xylanase. ở nồng độ Tween 20 2% (v/v), SDS 2% (v/v) hoạt tính tương đối giảm tương ứng từ 100% xuống còn 73% và 49% sau 2 giờ ủ. Riêng với Triton X-100 và Tween 80 làm tăng mạnh hoạt tính xylanase đạt từ 103% đến 117% (Bảng 3.2). Chủng A. oryzae
DMS1863 cho thấy ở nồng độ thấp (0,2 – 1%), Tween 20 và Triton X-100 hầu như không ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính xylanase. Hoạt tính xylanase lại giảm một cách rõ rệt ở nồng độ cao 2%. Trong khi đó, SDS làm giảm hoạt tính enzyme mạnh nhất ở tất cả các nồng độ [9].
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp
Chất tẩy rửa Hoạt tính xylanase còn lại (%)
Đối chứng 100±0,00
Trixton X-100 103±5,6
Tween 80 117±0,7
Tween 20 73±2,8
3.3.5. Ion kim loại
Các ion kim loại có vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc không gian của phân tử enzyme hoặc trong một vài trường hợp nó là nhân tố cần thiết trong trung tâm hoạt động enzyme. Do đó, các ion kim loại và các nhân tố bám có ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme.
Để khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại, xylanase được ủ cùng ion kim loại với nồng độ 10 mM ở nhiệt độ phòng, sau 2 giờ ủ hoạt tính còn lại được xác định kết quả cho thấy các ion kim loại Fe2+ Cu2+ Ag+ Hg+ Zn2+ làm giảm hoạt tính xylanase còn 0% đến 53% (Hình 3.3). Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt động Xyl P từ chủng tự nhiên A. niger DDB106 cho thấy: các ion Zn2+, Mn2+, Fe2+làm ức chế hoạt động của Xyl P. Sự có mặt của Na+
, K+, Ca2+, Cu2+, Co2+, Mg2+và thậm chí cả EDTA có tác dụng tăng cường hoạt lực của XylP [1].
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính của xylanase
Các ion kim loại 10mM Hoạt tính còn lại (%) 10mM ± SD Mg2+ 96 1,1 Fe2+ 44 5,8 Cu2+ 53 7,7 Ca2+ 99,6 13,5 Ag+ 43 9,1 Ni+ 96 3,1 K+ 101 0,1 EDTA 106 10,4 Zn2+ 43 5,3 Hg+ 0 0,0 Đối chứng 100 0,0
3.4.1. Tinh sạch enzyme tự nhiên
Với mục đích so sánh khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp với các chất chuẩn là D- xylose và L- arabinose, chúng tôi tiến hành tinh sạch xylanase tự nhiên từ chủng A. oryzae VTCC F187 là chủng gốc tự nhiên dùng để nhân dòng gene mã hóa enzyme xylanase và biểu hiện trong A. niger VTCC F017. Bằng phương pháp sắc ký lọc gel kết hợp với sắc ký trao đổi ion. Những phân đoạn qua cột Sephadex G200 có hoạt tính cao được đưa lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE- Sephadex.
Protein được phân tách thành 1 đỉnh rõ rệt trên sắc ký đồ Sephadex G200 (hình 3.7). Hoạt tính xylanase đặc hiệu của phân đoạn rất cao đạt 4659 IU/mg protein. Mức độ tinh sạch và khối lượng phân tử tương đối được xác định bằng điện di trên gel 12,5% polyacrylamide. Enzyme thu được khá sạch ở phân đoạn có băng protein 23 kDa và 39 kDa (hình 3.7B).
A B C
Hình 3.7: (A) Sắc ký đồ trên cột Sephadex G200; (B) Điện di đồ SDS-PAGE của A.
oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sephadex G200 (giếng 1: dịch nổi; giếng 2-6: các phân
đoạn 2,3,4,5 qua cột G200; M: Marker); (C): Điện di đồ SDS-PAGE của A. oryzae VTCC
F1 sau khi qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE (giếng 1: dịch nổi; giếng 2-5: các phân đoạn sau khi qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE; M: Marker)
Đặc biệt sau khi tập trung các phân đoạn trên cột Sephadex G200 có hoạt tính cao đưa lên cột sắc ký trao đổi ion DEAE. Sản phẩm trên điện di đồ SDS-PAGE cho thấy, xylanase tinh sạch có khối lượng khoảng 23kDa (Hình 3.7C). Từ những số liệu thu
0 1000 2000 3000 4000 5000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Các phân đoạn khác nhau
H oạt t ính x y lana s e (U I/ m gpro tein)
được cho thấy sau hai lần tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion, enzyme xylanase thu được có hoạt tính đặc hiệu đạt 6768 IU/mg protein với độ sạch 11 lần so với dịch enzym thô ban đầu, hiệu suất thu hồi 28 % (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Tóm tắt quá trình tinh sạch xylanase từ chủng gốc A. oryzae VTCC-F-187
Các bƣớc tinh sạch Hoạt tính tổng (IU/ml) Hàm lƣợng protein (mg/ml) Hoạt tính riêng (IU/mg) Độ sạch (lần) Hiệu suất (%) Dịch enzyme thô 114,3 0,1858 615 1 100 Sắc ký Sephadex G-200 78,7 0,0212 3768 6,13 43
Sắc ký trao đổi ion
DEAE-Sephadex 84,3 0,0126 6768 11 28
3.4.2. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp Chúng tôi sử dụng các mẫu enzyme xylanase thô, tinh sạch sơ bộ qua cột sephadex G200 và mẫu xylanase tinh sạch từ chủng gốc A. oryzae VTCC F187 và dịch enzyme xylanase tái tổ hợp để nghiên cứu khả năng thủy phân arabinoxylan. Theo Wong và cộng sự (1998) cho rằng xylanase chia thành 2 nhóm: nhóm 1 có khối lượng phân tử dưới 30 kDa có pI cao (thuộc họ 11 hay họ G), nhóm 2 có khối lượng phân tử lớn (Mw trên 30 kDa) có pI thấp (thuộc họ 10 hay họ F). Họ F ngoài hoạt tính xylanase, đôi khi chúng cũng thể hiện hoạt tính endocellulase. Các enzyme họ G có thể coi như là các xylanase thực sự chúng không có hoạt tính cellulase, có vùng xúc tác chủ yếu là các nếp gấp của dải β tạo nên khe hẹp hai lớp bao quanh điểm xúc tác [96]. Trong thí nghiệm này, chúng tôi bước đầu tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme xylanase tái tổ hợp thuộc enzyme họ G đều có khối lượng phân tử nhỏ hơn 25 kDa.
Thí nghiệm được sử dụng hai loại enzyme xylanase tự nhiên và tái tổ hợp ủ với cơ chất arabinoxylan thương mại được cung cấp từ trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH quốc gia Hà Nội và arabinoxylan (Megazym) trong 24 giờ, 55οC trong đệm potassium phosphate. Kết quả hình 3.8 và 3.9 cho thấy các enzyme đã thủy phân arabinoxylan
thành các băng vết rõ nét có vị trí ngang với chuẩn L- arabinose và D- xylose và một số đường khác, chứng tỏ arabinoxylan đã bị thủy phân. Tuy nhiên, khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên có vẻ rõ ràng hơn. Điều này chứng tỏ ở cùng một nồng độ enzyme, nhiệt độ xúc tác là 55oC (nhiệt độ tối ưu), trên 2 sản phẩm arabinoxylan đã được bán trên thị trường và arabinoxylan (Megazym), enzyme xylanase tự nhiên thủy phân sản phẩm tạo băng vết đậm hơn, rõ ràng hơn so với các enzyme tái tổ hợp.
A B
Hình 3.7: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân arabinoxylan lần lƣợt thƣơng mại và hãng của enzyme xylanase tự nhiên và enzyme tái tổ hợp với hệ dung môi
n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1)
Ghi chú:
CX: xylose chuẩn (Sigma); CA: L-arabinose chuẩn (Megazym); 1: Mẫu enzyme xylanase tự nhiên; 2: enzyme thô tự nhiên; 3: Dịch enzyme tinh sạch qua cột Sephadex; 4: Dịch enzyme tinh sạch bằng cột DEAE; 5: Dịch enzyme xylanase tái tổ hợp thô; 6: Dịch enzyme xylanase TTH tinh sạch
3.4.3. Khả năng phân giải cơ chất của xynalase tự nhiên và tái tổ hợp
Để đánh giá khả năng phân giải cơ chất của enzyme xylanase tái tổ hơp của chủng A. niger VTCC017/pANXylG2 và enzyme chủng tự nhiên A. oryzae VTCC-
F187, chúng tôi bước đầu thử nghiệm trên 6 loại cơ chất 0,8 % trong đệm potassium phosphate 20 mM pH 6,5 như: bột đậu tương, bột cám gạo, bột lõi ngô, bột bã mía, bột gỗ, và xylan pha trong đệm postadium phosphate 20 mM; pH 6,5. Trộn 1000 μl cơ chất với 200 μl enzyme, ủ ở 55οC, tại mỗi thời điểm 15- 30- 60- 90 phút. Dừng phản ứng bằng đun cách thủy 10 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch. Mẫu được chạy sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1).
Sản phẩm thủy phân của cơ chất xylan bởi enzyme tự nhiên và tái tổ hợp được kiểm tra trên sắc kí lớp mỏng TLC. Sản phẩm chính trong quá trình thủy phân cơ chất xylan được công bố là: xylotriose (X3), xylotetraose (X4) và xylopentose (X5). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của xylanase tái tổ hợp như Anxyl 10A từ A. usamii E001(Zhou et al. 2008) và AnxA từ A. niger (Liu et al. 2006). Điều đó chứng tỏ rằng các sản phẩm thủy phân chính của xylan bởi các enzyme xylanase là xylotriose (X3), xylotetraose (X4) và xylopenose (X5) trên 98% (Wang et al. 1998)
Cơ chất lõi ngô Cơ chất bã mía
Cơ chất gỗ mục Cơ chất xylan nồng độ 0,5%
Hình 3.9: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân cơ chất của enzyme xylanase
tự nhiên và enzyme tái tổ hợp sạch với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1)
Ghi chú:
TN: Xylanase tự nhiên thủy phân cơ chất; TTH: Xylanase tái tổ hợp; CX: chất chuẩn D- xylose; 15: dịch phản ứng lấy ra tại thời điểm thủy phân sau 15 phút; 30: dịch phản ứng lấy ra tại thời điểm thủy phân sau 30 phút; 60: Dịch phản ứng lấy ra tại thời điểm thủy phân sau 60 phút; 90: Dịch phản ứng lấy ra tại thời điểm thủy phân sau 90 phút
Kết quả hình 3.9 cho thấy xynalase tự nhiên và xylanase tái tổ hợp đều có khả năng phân giải các cơ chất khác nhau tạo thành các D-xylose và còn nhiều cơ chất
được thủy phân ở mức độ không hoàn toàn. Tuy nhiên trong 6 cơ chất khảo sát thì khả năng thủy phân cơ chất cám gạo của hai enzyme tự nhiên và tái tổ hợp là tốt nhất, gợi ý cho việc sử dụng nguồn bột cám gạo là nguồn cơ chất để tạo sản phẩm arabinoxylan bằng enzyme.
KẾT LUẬN
Từ những số liệu thu được chúng tôi thu được một số kết luận sau:
1. Đã tinh sạch thành công xylanase G2 tái tổ hợp trong Aspergillus niger
VTCC017/pANXlnG2. Xylanase tái tổ hợp được thể hiện trên điện di SDS-PAGE với trọng lượng phân tử khoảng 23 kDa, với hoạt tính xylanase G2 đạt 1102,5 U/mg, hiệu suất đạt 52% cùng với độ sạch là 2,2 lần.
2. Xylanase tái tổ hợp hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 55oC, pH 6,5. Enzyme tái tổ hợp bền ở dải nhiệt độ và pH; 25 - 40oC, pH 4-8. Hoạt tính xylanase bị ức chế đối với các kim loại nặng như Ag2+, Hg2+. Chất tẩy rửa Triton X-100 và Tween 80 làm tăng hoạt tính xylanase, SDS làm giảm hoạt tính. Các dung môi hữu cơ làm giảm hoạt tính