CHƢƠNG II PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp
2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xylanase
2.2.2.1. Định tính xylanase
Xylanase được định tính theo phương pháp khuếch tán enzym trên đĩa thạch [2].
Nguyên tắc:
Dựa vào khả năng thủy phân xylan của xylanase. Hoạt tính enzym được đánh giá theo bán kính vòng sáng do xylanase thủy phân xylan 0,5% tạo ra.
Tiến hành:
Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất xylan trong nước cất dày khoảng 0,5 cm, được đục lỗ đường kính 0,5 cm. 100 μl dịch enzym được cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4o
C cho enzym khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch được ủ 6 giờ ở 37oC lấy ra và nhuộm bằng lugol 1%. Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tương đối của enzym.
2.2.2.2. Định lượng xylanase
Hoạt tính xylanase được định lượng theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) [60].
Nguyên tắc:
Dịch enzym phản ứng với cơ chất xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở trong điều kiện pH, nhiệt độ và khoảng thời gian phản ứng là 5 phút. Hàm lượng đường khử giải phóng ra được định lượng bằng phản ứng với DNS và đo quang phổ bước sóng 540 nm. Độ hấp thụ được đối chiếu với đường chuẩn nồng độ đường xylose để tính hàm lượng đường giải phóng tương đương. Từ đó tính ra hoạt độ enzym.
Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ xylanase là lượng enzym phân giải cơ chất xylan thành đường khử tương đương 1 µmol xylose trong một phút ở điều kiện nhất định [60].
Tiến hành:
Xây dựng đường chuẩn: xylose được pha trong 100 mM đệm natri acetat pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 10-70 µg/ml. Tiến hành phản ứng với DNS và đo độ hấp thụ ở 540 nm. Độ hấp phụ và nồng độ xylose được vẽ theo chương trình Excel. Kết quả cho thấy, đuờng nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 10-70 µg/ml. Đường chuẩn có phương trình y = 0,0178x + 0,0312. Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 540 nm, x là nồng độ xylose (µg/ml) (Hình 2.1).
Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzym 0,4 ml được cho vào ống nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% xylan pha trong 20 mM đệm potasium phosphat pH 6,5. Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50oC, sau đó bổ sung ngay 1,25 ml DNS. Lắc đều hỗn hợp và đun cách thủy 5 phút. Sau đó, dịch được làm nguội và đo OD ở bước sóng 540 nm. Lặp lại 3 lần.
Ống kiểm tra: Hút 0,1 ml dịch enzyme, thêm 1,25 ml DNS, ủ 5 phút. Sau đó bổ sung 0,4 ml dung dịch 0,5% xylan pha trong 20 mM đệm potasium phosphat pH 6,5.
Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50oC. Sau đó đun cách thủy 5 phút. Dịch được làm nguội và đo OD ở bước sóng 540 nm.
Hình 2.1: Đƣờng chuẩn xylose
2.2.3. Xác định hàm lƣợng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [20].
Nguyên lý:
Các protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ protein. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò.
Tiến hành:
Dựng đường chuẩn: albumin huyết thanh bò (BSA) được pha trong nước muối sinh lý NaCl 0,9% với dải nồng độ 2,5-30 µg/ml. Cho 900 µl dung dịch Bradford working phản ứng với 100 µl dung dịch BSA chuẩn. Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Kết quả đường chuẩn
protein có phương trình y = 0,0031x + 0,1298 với y là độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm, x là nồng độ BSA (µg/ml) (Hình 2.2).
Hình 2.2: Đƣờng chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn
Ống thí nghiệm: Cho 900 µl dung dịch Bradford working phản ứng với 100 µl dung dịch protein. Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Lặp lại 3 lần.
Ống trắng: Cho 900 µl dung dịch bradford working phản ứng với 100 µl dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%. Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.
2.2.4. Tinh sạch xylanase
Đối với chủng tái tổ hợp:
Quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger tái tổ hợp được mô tả tóm tắt trong hình 2.3
Dịch enzym thô
Ly tâm 10000 vòng/phút,10 phút
Qua cột PronondTM
Enzym xylanase tinh sạch
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger
tái tổ hợp
Đối với chủng tự nhiên:
Dịch enzym thô
Ly tâm 10000 vòng/phút,10 phút
Qua cột sắc ký lọc gel (Sephadex G200)
Qua cột sắc ký trao đổi ion (DEAE-sephadex)
Enzym xylanase tinh sạch
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase từ chủng A. oryzae
tự nhiên
2.2.4.1. Tinh sạch xylanase tái tổ hợp bằng cột ProbondTM
Protein tái tổ hợp được tinh sạch sử dụng kit tinh sạch ProbondTM (Invitrogen). Cột tinh sạch 10ml theo kit được cho 2 ml resin vào, resin lắng xuống nhờ trọng lực và
hút nhẹ dịch nổi ra. Cột Ni2+ được rửa 2x với nước khử ion và đệm gắn cột (NBB) pH 8,0. Sau đó hút 9 ml protein (dịch nổi) cần tinh sạch đưa lên cột, đặt lên máy lắc rung nhẹ để các hạt resin luôn giữ ở trạng thái lơ lửng trong dịch protein 30-60 phút để xynalase gắn vào hạt resin. Tiếp theo, các hạt resin được để lắng và loại bỏ dịch trong cột. Cột được rửa 3x với đệm rửa (NWB) pH 8,0. Protein gắn cột được thôi ra bằng dung dịch (NEB) pH 8,0 với 11 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Hàm lượng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.
2.2.4.2. Tinh sạch xylanase tự nhiên
Tinh sạch xylanase bằng cột sắc ký Sephadex G-200
Đầu tiên, xylanase được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.
Nguyên lý:
Sắc ký lọc gel sẽ tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước và khối lượng các phân tử. Gel (các hạt hình cầu) nhồi vào cột tạo thành mạng lưới lỗ xốp. Khi hỗn hợp mẫu được nạp vào cột, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào các lỗ. Còn các phân tử kích thước lớn sẽ khó vào lỗ hơn, tiếp tục đi dọc theo cột; do đó, sẽ được rửa giải ra khỏi cột sớm hơn những phân tử nhỏ [31].
Tiến hành:
Dịch enzym thô (dịch lên men) sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi và đưa dịch nổi lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-200. Kích thước cột là 0,6 x 26 cm, được cân bằng với đệm kali phosphat 50 mM, pH 7,5. Tốc độ dòng chảy khoảng 25 ml/h. Thu thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzym được xác định trong mỗi phân đoạn.
Tinh sạch xylanase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex
Sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel, bước tiếp theo, xylanase được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex [25, 30].
Ở pH khác pI của protein, protein mang điện tích. Cho hỗn hợp protein chảy qua cột sắc ký chứa pha tĩnh (Diethylaminoethyl) là các hạt tích điện dương được gắn trong mạng lưới gel Sephadex. Các protein mang điện âm sẽ liên kết với pha tĩnh bằng lực ion mạnh hơn các protein mang điện dương. Hỗn hợp mẫu chất đang gắn vào pha tĩnh trong dung dịch đệm có nồng độ ion thấp. Pha động chạy qua cột có nồng độ ion lớn (nồng độ NaCl cao) sẽ cạnh tranh gắn pha tĩnh với protein, đẩy protein ra khỏi pha tĩnh, theo dòng chảy ra khỏi cột. Tùy thuộc vào điện tích mỗi protein mà lực ion mạnh yếu khác nhau, từ đó các protein sẽ được rửa giải ra khỏi cột ở những điểm khác nhau theo gradient nồng độ NaCl. Protein mang điện dương sẽ được rửa giải ra trước [25].
Tiến hành:
Các phân đoạn qua cột Sephadex G200 có hoạt tính xylanase cao nhất được đưa lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE-Sephadex. Cột có kích thước 0,6 x 26 cm được cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 chứa 50 mM NaCl.Tốc độ dòng chảy khoảng 24 ml/h. Thu mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 chứa NaCl với nồng độ NaCl tăng dần 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M và 1 M; sử dụng 10 ml đệm để thôi mẫu ứng với mỗi nồng độ. Thu thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzym được xác định trong mỗi phân đoạn.
2.2.5. Điện di SDS-PAGE
Gel polyacrylamid được sử dụng để điện di protein với nồng độ 12,5% theo phương pháp điện di biến tính của Laemmli (2011) [40].
Nguyên lý:
Các phân tử protein trong môi trường có SDS sẽ bị duỗi thẳng và tích điện âm, vì vậy sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng.
Tiến hành: gồm 3 bước.
1,5 cm; để đông hoàn toàn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cô ở phía trên, cài lược tạo các giếng riêng biệt, để 30 phút cho gel đông hoàn toàn. Thành phần gel được trình bày trong Bảng 2.4.
Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách
Thành phần Gel tách (µl) Gel cô (µl)
H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015
Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm xử lý mẫu dye 5x với tỷ lệ mẫu/dye là 5/1, biến tính ở 95oC trong 10 phút, sau đó để ở tủ -20 oC trong 1 phút
Điện di: Bản điện di được lắp vào hệ thống điện di, cường độ dòng điện 20 mA cho lớp gel cô và 35 mA cho lớp gel tách đến khi hàng mẫu chạy xuống đáy bản gel. Sau đó bản gel được tách khỏi phiến kính, nhuộm bằng dung dịch nhuộm PAGE trong 1,5-2 giờ. Bản gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy PAGE trong khoảng 2 giờ.
2.2.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase
2.2.6.1. Nhiệt độ phản ứng tối thích
Phản ứng của dịch enzyme tinh sạch và cơ chất 0,5% xylan trong đệm potassium phosphat 20 mM, pH 6,5 được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 37 - 80oC. Hoạt tính xylanase được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với thời gian ủ là thời gian phản ứng tối ưu.
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các đệm potasium phosphat 20 mM có pH khác nhau từ 3,5-8,0, sau đó tiến hành xác định hoạt tính theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959), với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, pH 6,5 ở nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
2.2.6.3. Xác định độ bền nhiệt độ
Dịch enzym tinh sạch được ủ từ 1, 5 và 24 giờ ở các nhiệt độ khác nhau từ 25, 37, 40, 50oC. Dịch enzym sau khi ủ được xác định hoạt tính theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959), với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ tối ưu.
2.2.6.4. Xác định độ bền pH
Dịch enzym tinh sạch được ủ với đệm potasium phosphat có nồng độ 20 mM với các pH khác nhau từ 4,0-8,0 sau các khoảng thời gian từ 1, 2, 8 và 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ tối ưu.
2.2.6.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các chất Tween 80, Tween 20, Trixton x100, SDS ở nồng độ 2% trong 1 giờ. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
2.3.5.6. Ảnh hưởng của các dung môi
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các dung môi: Methanol, ethanol, acetone, isopropanol, n-butanol trong 1 giờ. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các ion kim loại: Mg2+, Fe2+, Cu2+, Ca2+, Ag+, Ni+, K+, EDTA, Zn+, Hg+ với nồng độ 10 mM trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
2.2.6.8. Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase
Sử dụng cùng số đơn vị hoạt độ (khoảng 1 U cho 1 mg mẫu araninoxylan) của mỗi một loại enzyme xylanase để thủy phân arabinoxylan trong 24 giờ ở 55οC, trong đệm CH3COONa 50 mM, pH 5. Dịch mẫu sau khi thủy phân được bất hoạt enzyme ở 100oC trong 10 phút.
2.2.6.9. Thủy phân cơ chất bằng enzyme xylanase
Cơ chất: Bột đậu tương, bột cám gạo, bột lõi ngô, bột bã mía, bột gỗ mục, Xylan. Pha 5 g bột cơ chất với 40ml đệm phosphate 20 mM, pH 6,5. Trộn 1000 μl cơ chất với 200μl enzyme, ủ ở 55οC, tại mỗi thời điểm 15-30-60-90 phút 250 μl dung dịch đun cách thủy 10 phút để dừng phải ứng. Sau đó li tâm 10000v/ phút trong 10 phút. Rồi thu dịch chấm sắc kí (10 μl).
2.2.6.10. Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC Nguyên tắc:
Sắc ký bản mỏng bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính hoặc nhôm, là pha cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra sự phân tách các chất chấm trên bản gel. Do các chất di chuyển với tốc độ nhanh chậm khác nhau nên chúng dần dần được tách ra khỏi nhau dưới dạng các vết trên bản mỏng. Để đánh giá khả năng phân tách của từng chất trên bản sắc ký người ta quan tâm đến giá trị Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất trong hệ thống sắc ký, được tính bằng tỉ số giữa khoảng cách mà chất đó di chuyển được khỏi vệt xuất phát trên khoảng cách mà dung môi di chuyển được.
Rf = Trong đó:
a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử
b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến vạch mức cuối cùng mà dung môi chạy đến Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký có thể được hiển thị bằng các
phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn. Khi việc phân tách các chất trong hỗn hợp không rõ ràng, người ta có thể thay đổi thành phần và/ hoặc tỷ lệ của các dung môi trong hỗn hợp dung môi sắc ký. Việc bổ sung các chất không phân cực cũng như tăng tỷ lệ của chúng sẽ tạo điều kiện cho các chất ít phân cực chạy nhanh hơn khỏi vạch xuất phát và ngược lại [3].
Tiến hành:
Dùng pipet loại nhỏ hoặc dùng ống chấm sắc ký có chia vạch thể tích (5-10 μl) để hút mẫu và chấm lên các vị trí đã được đánh dấu trên bản gel. Bản gel sau khi chấm mẫu được đặt vào hệ thống bình sắc ký có nắp đậy, trong đó có chứa dung môi hữu cơ. Mức dung môi luôn được giữ thấp hơn vạch xuất phát của mẫu. Dung môi sẽ theo lớp gel để chạy ngược lên và mang theo các chất cần phân tích. Khi vạch dung môi chạy đến gần mép trên của bản gel sắc ký thì phải làm ngừng quá trình sắc ký. Bản gel được lấy ra, làm khô dung môi và sau đó có thể cho chạy lại một vài lần tương tự, tùy thuộc vào sự tách bạch giữa các mẫu quan tâm [3]. Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký được hiển thị bằng phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn là D-xylose và L-arabinose được mua từ hãng Megazyme.
2.2.7 Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm MS excel 2016 và GraphPad Prism 8.1.0. Các giá trị được biểu diễn dưới dạng X ± SD (X là giá trị trung bình).