3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
1.3.2. Tình hình nghiên cứu cây Sahchi
Trên thế giới, Brajesh và cs (2014) đã nghiên cứu mơ tả phƣơng pháp để tổng hợp các hạt nano cấu trúc bằng cách sử dụng sinh khối vỏ Sachi. Sinh khối vỏ Sachi nên đƣợc coi là một nguồn quan trọng của phytochemical cho sự tổng hợp và ổn định của các hạt nano bạc (AgNPs). Đặc tính của AgNP đƣợc thực hiện bằng quang phổ UV-vis, kính hiển vi điện tử truyền và chọn nhiễu xạ điện tử khu vực, chỉ ra rằng AgNps đƣợc tổng hợp thành cơng với kích thƣớc đạt 7,2 nm (Brajesh và cs, 2017).
Suppasawat và cs (2017) đã nghiên cứu chứng minh rằng Sachi trồng ở Thái Lan đã thể hiện hoạt tính kháng viêm trên đại thực bào chuột gây ra LPS RAW 264.7 tế bào bằng cách ức chế mức độ biểu hiện mRNA của các chất trung gian gây viêm bao gồm COX-2, iNOS, TNF-α và TGF- β (Suppasawat, 2017).
Ơng Wattanapan và cs (2017) nghiên cứu khảo sát điều kiện nuơi cấy thích hợp cho sinh trƣởng của callus và sản xuất hợp chất hoạt tính sinh học của callus Sachi. Kết quả cho thấy mơi trƣờng MS bổ sung 2,5 mg/L
2,4-D là điều kiện tối ƣu cho sự kích thích callus của Sachi. Cĩ đến 43 hợp chất chuyển hĩa thứ cấp đƣợc phát hiện từ callus đƣợc chiết xuất bởi dung mơi axit axetic và nĩ là tác nhân kháng khuẩn với điều trị vết thƣơng mãn tính. 2,3-butanediol đƣợc sử dụng nhƣ là trung gian trong sản xuất acetone và diacetyl cũng đƣợc phát hiện từ nghiên cứu này (Wattanapan, 2017).
Leyva và cs (2016) đã phát triển các phƣơng pháp nuơi cấy in vitrio của Sachi ở các mơ, cơ quan (Solis, 2007). Năm 2018, Solis và cs đánh giá các giai đoạn của quá trình phát sinh hình thái in vitro của chồi ngọn Sachi đã
nhận thấy,mơi trƣờng tốt nhất đối với giai đoạn nhân nhanh chồi in vitro
Sachi là mơi trƣờng MS bổ sung 0,1 mg/l BAP và 0,05 mg/l NAA. Để tạo rễ
in vitro, mơi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l NAA và 2 mg/l IBA là thích hợp
nhất (Solis và cs., 2019).
Ở Việt Nam, năm 2014, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã khảo nghiệm cây Sachi tại Học viện. Kết quả cho thấy, với tỷ lệ sống 99%, bắt đầu ra hoa sau 3-5 tháng trồng, 6-8 tháng là cho thu hoạch quả chứng tỏ loại cây leo bán thân gỗ này (ngọn là dây leo, dƣới gốc hĩa gỗ) khá phù hợp với điều kiện khí hậu ở nƣớc ta. Những nghiên cứu về nhân giống in vitro cây Sachi cịn rất mới và hạn chế, chỉ cĩ Lê Thị Thủy và Nguyễn Thị Nhung (2019) đã khảo sát mơi trƣờng nuơi cấy in vitro từ
đoạn thân cây Sachi cho thấy, hạt Sachi đuợc khử trùng bằng NaOCl 5% trong 30 phút cho tỉ lệ mẫu sạch nảy mầm cao nhất đạt 78,29%. Hạt cĩ tốc độ nảy mầm nhanh khi gieo trên mơi trƣờng MS bổ sung 20 g/l sucrose, 7 g/l agar với chiều cao cây đạt 14,52 cm. Sử dụng đoạn thân giữa lá thật 1 và lá thật 2 của cây con in vitro nảy mầm từ hạt cho khả năng tái sinh cao nhất với tỉ lệ mẫu tạo chồi là 72,22%. Ðoạn thân sau 4 tuần nuơi cấy trên mơi trƣờng MS bổ sung 0,1 mg/l BAP và 0,1 mg/l IBA đã tái sinh tạo trung bình 4,67 chồi/mẫu. Các chồi cĩ chất luợng tốt đạt chiều cao 1,75 cm, số lá
trung bình là 2,50. Chồi sau đĩ đƣợc chuyển sang mơi truờng ra rễ cĩ bổ sung IBA 0,5 mg/l, tỉ lệ chồi ra rễ đạt 9 0%, số luợng rễ trung bình đạt 5,85 rễ/chồi (Lê Thị Thủy và cs, 2019).
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
+ Đối tƣợng nghiên cứu: là cây Sachi (Plukenetia volubilis L.), thuộc
họ thầu dầu (Euphorbiaceae).
Hình 2.1. Cây Sachi ngồi tự nhiên
+ Nguyên liệu nghiên cứu:
Sử dụng hạt của cây Sachi đƣợc cung cấp từ từ Cơng ty cổ phần Sachi Việt Nam làm nguyên liệu để tạo mẫu in vitro khởi đầu, dùng cho các nghiên cứu trong xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Sachi.
2.2. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
+Thời gian nghiên cứu: từ tháng 06/2019 đến tháng 02/2020.
+ Đề tài tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sachi tại phịng thí
nghiệm Cơng nghệ Nuơi cấy mơ và Tế bào Thực vật, khoa Sinh – Mơi trƣờng, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Xây dựng qui trình nhân nhanh giống in vitro cây Sachi.
+ Nghiên cứu các điều kiện khử trùng mẫu hạt Sachi để tạo mẫu khởi đầu in vitro;
in vitro cây Sachi;
+ Nghiên cứu của chất ĐHST đến khả năng tạo rễ in vitro và hình thành
cây in vitro hồn chỉnh.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.4.1. Phƣơng pháp vơ trùng mẫu vật
Mẫu hạt Sachi đƣợc lấy từ cơng ty cổ phần Sachi Việt Nam, đƣợc rửa sạch dƣới vịi nƣớc chảy trong vịng 15 phút, lắc trong bình xà phịng khoảng 10 phút và rửa sạch dƣới vịi nƣớc chảy 15 phút. Tiến hành vơ trùng trong tủ cấy bởi cồn 700
trong 30 giây, sau đĩ rửa lại bằng nƣớc cất khoảng 3 - 4 lần, ngâm trong Javel 5% trong vịng 20 phút, tiếp theo rửa lại bằng nƣớc cất 3 - 4 lần. Hạt sau khi khử trừng, tiến hành bĩc vỏ ngồi và nuơi cấy trên mơi trƣờng MS, cĩ 30g/L saccharose, 8g/L agar, pH=5,8, và khơng bổ sung chất ĐHST. Đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu hạt sau 3 tuần nuơi cấy thơng qua các chỉ tiêu: tỉ lệ mẫu hạt nhiễm (%), tỉ lệ mẫu hạt chết (%).
Hạt Sachi
Vơ trùng hạt Nảy mầm
Tái sinh chồi
in vitro
Tạo rễ in vitro
2.4.2. Phƣơng pháp nhân chồi in vitro Sachi
Sử dụng mẫu đoạn thân chứa mắt lá (dài 1,0 – 1,5 cm) của cây in vitro
nảy mầm từ hạt (4 tuần tuổi) nuơi cấy trên mơi trƣờng MS cĩ 30g/L saccharose, 8g/L agar, pH = 5,8; bổ sung BAP (1,0 – 5,0 mg/L; KIN (1,0 – 3,0 mg/L; BAP 0,5 mg/l + IBA (0,1 – 0,3 mg/l); BAP (0,5 mg/l + NAA (0,05 – 0,25 mg/l); TDZ (0,1 – 0,4 mg/l). Đánh giá khả năng nhân nhanh chồi in vitro thong qua các chỉ tiêu: số chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi, số lá/chồi sau 4
tuần nuơi cấy.
2.4.3. Phƣơng pháp tạo rễ in vitro
Để tạo rễ, hình thành cây in vitro hồn chỉnh, các chồi in vitro 8 tuần
tuổi (cao khoảng 2,5 cm; 3– 4 lá) đƣợc cấy vào mơi trƣờng MS, ½MS; ¼ MS cĩ 30g/L saccharose, 8g/L agar, pH=5,8; khơng bổ sung chất ĐHST và mơi trƣờng MS cĩ 30g/L saccharose, 8g/L agar, pH=5,8; bổ sung chất IBA (0,25 – 1,0 mg/l). Đánh giá ảnh hƣởng của mơi trƣờng khống MS và chất ĐHST đến khả năng tái sinh rễ in vitro thơng qua tỷ lệ mẫu chồi ra rễ, số rễ/chồi sau thời gian 3 tuần nuơi cấy.
2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm trên đƣợc bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu đƣợc xử lý bằng chƣơng trình Excel 2010 và phần mềm Statistix version 9.0.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. HIỆU QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU HẠT VÀ KHẢ NĂNG NẢY MẦM
IN VITRO TỪ HẠT
Điều kiện dinh dƣỡng trong nuơi cấy in vitro rất thuận lợi cho sự phát
triển của vi khuẩn và nấm. Điều quan trọng nhất trƣớc khi bắt đầu nuơi cấy là tạo nguồn vật liệu ban đầu vơ trùng, khử trùng khơng thành cơng cản trở tiến trình nghiên cứu nuơi cấy mơ trong nhân giống in vitro. Tạo nguồn vật liệu
ban đầu là một khâu hết sức quan trọng quyết định sự thành cơng trong việc nuơi cấy mơ. Tuổi cây mẹ và điều kiện khử trùng mẫu vật là hai trong số các yếu tố đĩng vai trị quan trọng trong thành cơng và hiệu quả nhân giống in vitro (Tơ Việt Diễm Ca và cs, 2006). Hạt sachi đuợc lấy ngồi tự nhiên nên
cần phải khử trùng đảm bảo cho mẫu đƣa vào mơi trƣờng nuơi cấy sạch, cĩ khả năng nảy mầm in vitro tạo nguyên liệu khởi đầu. Do vậy, việc nghiên cứu xác định điều kiện khử trùng phù hợp sẽ gĩp phần xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho giống cây Sachi đạt hiệu quả cao.
Quá trình khử trùng bề mặt nhằm loại bỏ tất cả các vi sinh vật cĩ thể dễ dàng phát triển trong ống nghiệm. Mặt khác nĩ phải đảm bảo khả năng sống sĩt và khả năng tái sinh của mẫu nuơi cấy. Trong quá trình khử trùng, do sự tiếp xúc trực tiếp giữa mẫu vật và hĩa chất khử trùng nên ảnh hƣởng đến sự nảy mầm hay sự tái tạo mơ của mẫu vật. Hiệu quả khử trùng ảnh hƣởng bởi cách lấy mẫu, nồng độ, thời gian sử dụng các chất khử trùng (Đỗ Năng Vịnh, 2002). Theo đánh giá của Trần Văn Minh (1999), HgCl2 và javel đều là những chất cĩ khả năng khử trùng tốt. Mẫu vật hạt đƣợc xử lý trƣớc khi đƣa vào tủ cấy và tiến hành các bƣớc khử trùng. Tuy nhiên HgCl2 là một chất hĩa học cĩ thể gây độc đối với cơ thể ngƣời. Do đĩ, trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát hiệu
quả khử trùng mẫu vật với cồn 70o
và Javel 5% với thời gian khử trùng khác nhau. Kết quả thu đƣợc đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng hạt Sachi bằng dung dịch cồn 70o
Thời gian khử trùng (giây) Hiệu quả khử trùnghạt Tỉ lệ mẫuhạt nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu hạt chết (%) Tỉ lệ hạt nảy mầm (%) 15 100a 0 0 30 100a 0 0 45 97,33b 2,67b 0 60 90,67c 9,33a 0
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, khi sử dụng cồn 70o
để khử trùng hạt Sachi khơng mang lại hiệu quả cao. Ở khoảng thời gian khử trùng 15 và 30 giây, tỷ lệ mẫu nhiễm là 100%. Tuy nhiên, khi tăng thời gian khử trùng lên 45 giây tỷ lệ mẫu giảm dần khoảng 97,33%, tỷ lệ mẫu chết 2,67%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 60 giây thì tỷ lệ mẫu nhiễm lại chỉ cịn 90,67%, tỷ lệ mẫu chết 9,33%. Đối với chất khử trùng là cồn 70o
thì ở tất cả các khoảng thời gian hạt cây Sachi đều khơng cĩ khả năng tái sinh chồi. Điều này cĩ thể lý giải theo Chen và cs (2015), nảy mầm in vitro cĩ thành cơng hay khơng phụ thuộc vào điều kiện của hạt, chẳng hạn nhƣ độ chín của vỏ quả và nguồn gốc, cũng nhƣ là điều kiện vật lí cho nảy mầm và thành phần trong mơi trƣờng phát triển. Trong trƣờng hợp này rất cĩ thể là do mơi trƣờng nảy mầm in vitro chƣa phù hợp, cần thiết bổ sung chất ĐHSTđể kích thích sự nảy mầm của hạt.
Chúng tơi tiếp tục tiến hành khảo sát hiệu quả khử trùng mẫu vật với cồn 70o trong thời gian khử trùng 60 giây kết hợp với Javel 5% trong các khoảng thời gian khác nhau. Kết quả nghiên cứu thu đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng hạt Sachi bằng cồn 70o và Javel 5% Chấtkhử trùng Hiệu quả khử trùng Cồn 70o Javel 5% Tỷ lệ mẫuhạt nhiễm (%) Tỉ lệ mẫuhạt chết (%) Tỷ lệ hạt nảy chồi (%) 60 giây 5 phút 83,33a 0 17,67e 60 giây 10 phút 50b 0 50d 60 giây 15 phút 19,7c 0 80,3c 60 giây 20 phút 0 0 100a 60 giây 25 phút 0 0 100a 60 giây 30 phút 0 9,3a 90,7b
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.
Kết quả cho thấy, đối với nguồn mẫu là hạt thì việc khử trùng kết hợp giữa cồn 70o
trong 60 giây và Javel 5% trong 20 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất, tỷ lệ nhiễm là 0% và tỷ lệ nảy chồi là 100%. Khi tăng thời gian khử trùng bằng Javel 5% lên 25 phút thì hiệu quả khử trùng vẫn đạt mức cao nhất. Khi tăng thời gian khử trùng Javel 5% lên 30 phút thì tỉ lệ nảy chồi giảm xuống cịn 90,7% và tỉ lệ mẫu chết là 9,3%. Điều này cĩ thể lý giải rằng khi tăng thời gian khử trùng của NaOCl 5% lên thì các tác nhân gây nhiễm nhƣ nấm và vi sinh vật bị tiêu diệt làm cho tỉ lệ nhiễm giảm rõ rệt nhƣng khi thời gian khử của NaOCl tăng lên quá cao sẽ ảnh hƣởng đến hạt giống, làm phá vỡ lớp vỏ hạt gây tổn thƣơng đến phơi phía trong hạt và cuối cùng ảnh hƣởng đến tỷ lệ tái sinh chồi của mẫu đƣợc khử trùng. Do đĩ, thời gian của NaOCl 5% phải phù hợp cho việc khử trùng là vừa đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm nhƣng lại khơng gây tổn thƣơng đến mẫu hạt. Nhƣ vậy, sử dụng cồn 70o
trong 60 giây và Javel 5% trong 20 phút để khử trùng hạt cho kết quả tốt nhất. Sau khi đánh giá hiệu quả khử của chất khử trùng, chúng tơi tiếp tục tiến hành khảo sát tình trạng của mẫu và quá trình nảy mầm tạo chồi của mẫu hạt Sachi ở các tiêu chí về thời gian nảy mầm (ngày) và chiều cao của cây (cm). Kết quả nghiên cứu đƣợc ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất khử trừng đến khả năng nảy mầm hạt và sinh trưởng
Chất khử trùng Khảnăng nảy mầm và sinh trưởng
Cồn 70o Javel 5% Thời gian nảy mầm
(ngày)
Chiều cao cây (cm) 60 giây 5 phút 12a 3,33d 60 giây 10 phút 10b 3,33d 60 giây 15 phút 9c 4,33c 60 giây 20 phút 7d 5,67a 60 giây 25 phút 7,33d 4,67b 60 giây 30 phút 7d 4,39c
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.
Hình 3.1. Hạt cây Sachi nảy mầm khi khử trùng cồn 70 o
trong 60 giây và Javel 5% trong 20 phút. Sau 01 tuần (A), 02 tuần (B), 03 tuần (C), 04 tuần
(D) nuơi cấy
A B
Mẫu hạt Sachi đƣợc theo dõi sau 4 tuần nuơi cấy, nhận thấy cĩ sự khác nhau về thời gian nảy mầm của hạt và chiều cao của cây Sachi. Ở thời gian khử trùng cồn 70o
trong 60 giây kết hợp với Javel 5% trong 20 phút thì thời gian nảy mầm nhanh nhất, hạt nảy mầm sau 7 ngày nuơi cấy, chiều cao cây 5,67 cm (Bảng 3.3). Khi thời gian khử trùng tăng lên, hạt nảy mầm cho cây con cĩ sức sống kém hơn (thời gian nảy mầm 7 ngày nhƣng chiều cao chỉ 4,67 cm và chồi khơng đƣợc xanh tốt). Khi giảm thời gian khử trùng thì kết quả cho thấy thời gian nảy mẩm lâu hơn và chiều cao cây thấp hơn rất nhiều.
Thí nghiệm này của chúng tơi chỉ sử dụng chất khử trùng là cồn và Javel vì 2 chất này phổ biến, rẻ tiền và khơng gây độc hại. Đối với HgCl2 theo một số nghiên cứu thì nĩ là chất khử trùng hiệu quả tuy nhiên nĩ lại là một chất độc hai, khơng tốt cho sức khỏe. Nhƣ vậy, phƣơng pháp khử trùng với cồn 70o trong thời gian 60 giây kết hợp với Javel 5% trong thời gian 20 phút đạt hiệu quả tốt nhất và mẫu đƣợc sử dụng để thực hiện các bƣớc tiếp theo trong nghiêm.
3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT ĐHST ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI
IN VITRO SACHI
Đây đƣợc xem nhƣ giai đoạn quan trọng nhất của quy trình nhân giống
in vitro. Sự phân hĩa hình thành chồi từ các đoạn thân cĩ mắt lá trƣớc khi
chuyển sang mơi trƣờng tạo cây hồn chỉnh phụ thuộc rất lớn vào chất ĐHST cĩ trong mơi trƣờng nuơi cấy (Quazi, 1980; Tsuro và cs, 1999; Cavanagh và cs, 2002).
Trong giai đoạn này, chất ĐHST ảnh hƣởng đến sự phân hĩa hình thành chồi bên từ các đoạn thân. Trong đĩ, việc xác định loại và nồng độ chất ĐHST là những khía cạnh quan trọng của quá trình tối ƣu hĩa quy trình nhân giống in vitro (Lê Văn Hồng, 2007).
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, nhân lên, kích thích sự hoạt động của mơ phân sinh ở chồi nách dẫn đến cảm ứng và hình thành chồi trong nuơi cấy mơ. Ðể cĩ thể tạo đƣợc số luợng chồi lớn và hệ số nhân cao nhất, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh huởng của chất ÐHST đến khả năng tái sinh
in vitro của cây Sachi.
3.2.1. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro
Cytokinin là một trong những chất ĐHST cho sự trƣởng, phát triển của cây và đƣợc biết đến nhƣ một chất thúc đẩy quá trình phân chia tế bào. Các loại cytokinin khác nhau cĩ thể kích thích sự phát triển của các chồi bên. Do