3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.1.HIỆU QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU HẠT VÀ KHẢ NĂNG NẢY MẦM IN
IN VITRO TỪ HẠT
Điều kiện dinh dƣỡng trong nuơi cấy in vitro rất thuận lợi cho sự phát
triển của vi khuẩn và nấm. Điều quan trọng nhất trƣớc khi bắt đầu nuơi cấy là tạo nguồn vật liệu ban đầu vơ trùng, khử trùng khơng thành cơng cản trở tiến trình nghiên cứu nuơi cấy mơ trong nhân giống in vitro. Tạo nguồn vật liệu
ban đầu là một khâu hết sức quan trọng quyết định sự thành cơng trong việc nuơi cấy mơ. Tuổi cây mẹ và điều kiện khử trùng mẫu vật là hai trong số các yếu tố đĩng vai trị quan trọng trong thành cơng và hiệu quả nhân giống in vitro (Tơ Việt Diễm Ca và cs, 2006). Hạt sachi đuợc lấy ngồi tự nhiên nên
cần phải khử trùng đảm bảo cho mẫu đƣa vào mơi trƣờng nuơi cấy sạch, cĩ khả năng nảy mầm in vitro tạo nguyên liệu khởi đầu. Do vậy, việc nghiên cứu xác định điều kiện khử trùng phù hợp sẽ gĩp phần xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho giống cây Sachi đạt hiệu quả cao.
Quá trình khử trùng bề mặt nhằm loại bỏ tất cả các vi sinh vật cĩ thể dễ dàng phát triển trong ống nghiệm. Mặt khác nĩ phải đảm bảo khả năng sống sĩt và khả năng tái sinh của mẫu nuơi cấy. Trong quá trình khử trùng, do sự tiếp xúc trực tiếp giữa mẫu vật và hĩa chất khử trùng nên ảnh hƣởng đến sự nảy mầm hay sự tái tạo mơ của mẫu vật. Hiệu quả khử trùng ảnh hƣởng bởi cách lấy mẫu, nồng độ, thời gian sử dụng các chất khử trùng (Đỗ Năng Vịnh, 2002). Theo đánh giá của Trần Văn Minh (1999), HgCl2 và javel đều là những chất cĩ khả năng khử trùng tốt. Mẫu vật hạt đƣợc xử lý trƣớc khi đƣa vào tủ cấy và tiến hành các bƣớc khử trùng. Tuy nhiên HgCl2 là một chất hĩa học cĩ thể gây độc đối với cơ thể ngƣời. Do đĩ, trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát hiệu
quả khử trùng mẫu vật với cồn 70o
và Javel 5% với thời gian khử trùng khác nhau. Kết quả thu đƣợc đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng hạt Sachi bằng dung dịch cồn 70o
Thời gian khử trùng (giây) Hiệu quả khử trùnghạt Tỉ lệ mẫuhạt nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu hạt chết (%) Tỉ lệ hạt nảy mầm (%) 15 100a 0 0 30 100a 0 0 45 97,33b 2,67b 0 60 90,67c 9,33a 0
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, khi sử dụng cồn 70o
để khử trùng hạt Sachi khơng mang lại hiệu quả cao. Ở khoảng thời gian khử trùng 15 và 30 giây, tỷ lệ mẫu nhiễm là 100%. Tuy nhiên, khi tăng thời gian khử trùng lên 45 giây tỷ lệ mẫu giảm dần khoảng 97,33%, tỷ lệ mẫu chết 2,67%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 60 giây thì tỷ lệ mẫu nhiễm lại chỉ cịn 90,67%, tỷ lệ mẫu chết 9,33%. Đối với chất khử trùng là cồn 70o
thì ở tất cả các khoảng thời gian hạt cây Sachi đều khơng cĩ khả năng tái sinh chồi. Điều này cĩ thể lý giải theo Chen và cs (2015), nảy mầm in vitro cĩ thành cơng hay khơng phụ thuộc vào điều kiện của hạt, chẳng hạn nhƣ độ chín của vỏ quả và nguồn gốc, cũng nhƣ là điều kiện vật lí cho nảy mầm và thành phần trong mơi trƣờng phát triển. Trong trƣờng hợp này rất cĩ thể là do mơi trƣờng nảy mầm in vitro chƣa phù hợp, cần thiết bổ sung chất ĐHSTđể kích thích sự nảy mầm của hạt.
Chúng tơi tiếp tục tiến hành khảo sát hiệu quả khử trùng mẫu vật với cồn 70o trong thời gian khử trùng 60 giây kết hợp với Javel 5% trong các khoảng thời gian khác nhau. Kết quả nghiên cứu thu đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng hạt Sachi bằng cồn 70o và Javel 5% Chấtkhử trùng Hiệu quả khử trùng Cồn 70o Javel 5% Tỷ lệ mẫuhạt nhiễm (%) Tỉ lệ mẫuhạt chết (%) Tỷ lệ hạt nảy chồi (%) 60 giây 5 phút 83,33a 0 17,67e 60 giây 10 phút 50b 0 50d 60 giây 15 phút 19,7c 0 80,3c 60 giây 20 phút 0 0 100a 60 giây 25 phút 0 0 100a 60 giây 30 phút 0 9,3a 90,7b
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.
Kết quả cho thấy, đối với nguồn mẫu là hạt thì việc khử trùng kết hợp giữa cồn 70o
trong 60 giây và Javel 5% trong 20 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất, tỷ lệ nhiễm là 0% và tỷ lệ nảy chồi là 100%. Khi tăng thời gian khử trùng bằng Javel 5% lên 25 phút thì hiệu quả khử trùng vẫn đạt mức cao nhất. Khi tăng thời gian khử trùng Javel 5% lên 30 phút thì tỉ lệ nảy chồi giảm xuống cịn 90,7% và tỉ lệ mẫu chết là 9,3%. Điều này cĩ thể lý giải rằng khi tăng thời gian khử trùng của NaOCl 5% lên thì các tác nhân gây nhiễm nhƣ nấm và vi sinh vật bị tiêu diệt làm cho tỉ lệ nhiễm giảm rõ rệt nhƣng khi thời gian khử của NaOCl tăng lên quá cao sẽ ảnh hƣởng đến hạt giống, làm phá vỡ lớp vỏ hạt gây tổn thƣơng đến phơi phía trong hạt và cuối cùng ảnh hƣởng đến tỷ lệ tái sinh chồi của mẫu đƣợc khử trùng. Do đĩ, thời gian của NaOCl 5% phải phù hợp cho việc khử trùng là vừa đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm nhƣng lại khơng gây tổn thƣơng đến mẫu hạt. Nhƣ vậy, sử dụng cồn 70o
trong 60 giây và Javel 5% trong 20 phút để khử trùng hạt cho kết quả tốt nhất. Sau khi đánh giá hiệu quả khử của chất khử trùng, chúng tơi tiếp tục tiến hành khảo sát tình trạng của mẫu và quá trình nảy mầm tạo chồi của mẫu hạt Sachi ở các tiêu chí về thời gian nảy mầm (ngày) và chiều cao của cây (cm). Kết quả nghiên cứu đƣợc ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất khử trừng đến khả năng nảy mầm hạt và sinh trưởng
Chất khử trùng Khảnăng nảy mầm và sinh trưởng
Cồn 70o Javel 5% Thời gian nảy mầm
(ngày)
Chiều cao cây (cm) 60 giây 5 phút 12a 3,33d 60 giây 10 phút 10b 3,33d 60 giây 15 phút 9c 4,33c 60 giây 20 phút 7d 5,67a 60 giây 25 phút 7,33d 4,67b 60 giây 30 phút 7d 4,39c
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.
Hình 3.1. Hạt cây Sachi nảy mầm khi khử trùng cồn 70 o
trong 60 giây và Javel 5% trong 20 phút. Sau 01 tuần (A), 02 tuần (B), 03 tuần (C), 04 tuần
(D) nuơi cấy
A B
Mẫu hạt Sachi đƣợc theo dõi sau 4 tuần nuơi cấy, nhận thấy cĩ sự khác nhau về thời gian nảy mầm của hạt và chiều cao của cây Sachi. Ở thời gian khử trùng cồn 70o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trong 60 giây kết hợp với Javel 5% trong 20 phút thì thời gian nảy mầm nhanh nhất, hạt nảy mầm sau 7 ngày nuơi cấy, chiều cao cây 5,67 cm (Bảng 3.3). Khi thời gian khử trùng tăng lên, hạt nảy mầm cho cây con cĩ sức sống kém hơn (thời gian nảy mầm 7 ngày nhƣng chiều cao chỉ 4,67 cm và chồi khơng đƣợc xanh tốt). Khi giảm thời gian khử trùng thì kết quả cho thấy thời gian nảy mẩm lâu hơn và chiều cao cây thấp hơn rất nhiều.
Thí nghiệm này của chúng tơi chỉ sử dụng chất khử trùng là cồn và Javel vì 2 chất này phổ biến, rẻ tiền và khơng gây độc hại. Đối với HgCl2 theo một số nghiên cứu thì nĩ là chất khử trùng hiệu quả tuy nhiên nĩ lại là một chất độc hai, khơng tốt cho sức khỏe. Nhƣ vậy, phƣơng pháp khử trùng với cồn 70o trong thời gian 60 giây kết hợp với Javel 5% trong thời gian 20 phút đạt hiệu quả tốt nhất và mẫu đƣợc sử dụng để thực hiện các bƣớc tiếp theo trong nghiêm.