thuộc chi Lan kim tuyến
1.3.1.1. Trên thế giới
Mặc dù chi chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) có số lượng loài nhiều, tuy nhiên số loài được nghiên cứu thành phần dược tính chưa nhiều, chủ yếu được thực hiện ở một số quốc gia Châu Á, như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan, Việt Nam,…
Từ xa xưa người dân địa phương ở các vùng núi hay các quần đảo của Đài Loan, nơi có sự phân bố của các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus
Blume) đã biết sử dụng các loài này để chữa rắn cắn, mất ngủ (Teoh ES, et al; 2016) [85]. Tại Trung Quốc, loài Lan gấm (A.formosanus), Kim tuyến tơ (A.setaceus)
được sử dụng trong rất nhiều bài thuốc chữa các bệnh khác nhau.
Zhen-Ling Liu (2013) [105] tìm ra hợp chất Kinsenoside phân lập từ cây Giải thuỳ tơ (A.roxburghii) có tác dụng bảo vệ mạch máu thông qua việc duy trì
chức năng nội mô mạch máu và cân bằng nội mô. Tác giả Zeng et at (2017) [101] cho biết y học cổ truyền Trung Quốc sử dụng Giải thuỳ tơ (A.roxburghii) điều trị các loại viêm gan mãn tính và cấp tính, từ đó đã nghiên cứu tìm ra hoạt chất polysaccharide (ARPT) làm giảm đáng kể hoạt động ALT (activities of alanine transaminase), AST (aspartate transaminase) huyết thanh, mức MDA (malondialdehyde), tăng cường rõ rệt hoạt động của enzym chống oxy hóa (SOD, CAT và GSH-Px) và mức GSH (glutathione peroxidase) trong mô gan ở chuột. Những phát hiện này cho thấy ARPT có tác dụng bảo vệ gan chống lại CCl4 gây ra độc tính trên gan ở chuột và một phận hoạt động làm giảm stress, oxy hóa, viêm và sự chết tế bào.
Theo Yeo-Joong Yoon và cộng sự, (2007) [99], Kumar P & S.W. Gale, 2020)[71], ở Trung Quốc và Đài Loan, Lan gấm (A.formosanus) là cây thuốc dân gian đắt tiền, được mệnh danh là "Vua của Thuốc”. Kan WS (1986) [67] cho biết Lan gấm (A.formosanus) rất tốt cho người huyết áp cao, yếu sinh lý, các bệnh về gan, rối loạn lá lách, viêm màng phổi, phòng ngừa u bướu và tim mạch. Ở một số nước, như: Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, từ lâu đờiLan gấm (A.formosanus) đã được sử dụng là một bài thuốc dân gian điều trị ung thư, tăng huyết áp, đái tháo đường và viêm thận (Liang và cộng sự, 1990) [73]. Theo Chiu NY và Chang Cs (1995) [55] uống trà Lan gấm (A.formosanus) giúp chữa các chứng bệnh gan, phổi, tiểu đường, viêm thận và kháng vi rút. Wang SY và cộng sự (2002)[92] đã chiết xuất từ Lan gấm (A.formosanus) được các hợp chất: hydroxycinnamic acid, β- sitosterol, β-D-glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid là những chất có khả năng chống ô xy hóa mạnh, Wang LF và cộng sự (2005)[91] đã phân lập được một hợp chất mới là kinsenone và một số flavonoid glycosides đã biết như quercetin và isorhamnetin từ dịch chiết Lan gấm (A.formosanus) có đặc tính chống oxy hóa mạnh, ngoài ra còn chứa hợp chất chuyển hoá acid arachidonic liên quan đến chức năng tim mạch. Tác giả Ikeuchi M và cộng sự (2005)[66] đã nghiên cứu sử dụng dịch chiết Lan gấm (A.formosanus) trên chuột, kết quả cho thấy dịch chiết này có tác dụng làm giảm đáng kể sự tích lũy chất béo trong gan, dạ dày và cơ bắp nhờ cơ chế kích hoạt việc sử dụng lipid nhiều hơn glucose để tạo thành nguồn năng lượng
cho hiệu suất. Tseng CC at. al, (2006) [87] đã nghiên cứu sử dụng chiết xuất Lan gấm (A.formosanus) có hoạt động ức chế khối u mạnh mẽ ở chuột (BALB/c) sau khi cấy ghép tế bào ung thư ruột kết CT-26 dưới da. Tỷ lệ ức chế khối u của chuột được dùng Lan gấm (A.formosanus) 2 ngày trước khi cấy ghép khối u và được điều trị thêm trong 12 ngày liên tiếp, lần lượt là 55,4% và 58,9% ở liều uống 50 và 10 mg/chuột mỗi ngày. Ngay cả đối với những con chuột mang khối u, sau khi uống chiết xuất nước của Lan gấm (A.formosanus) trong 12 ngày liên tục, tỷ lệ ức chế khối u là vẫn là 23,8% và 40,5% tương ứng với liều 50 và 10 mg/chuột. Vì nước chiết có nồng độ thấp của Lan gấm (A. formosanus) không cho thấy độc tính tế bào trực tiếp trong các tế bào khối u CT-26, nhóm nghiên cứu đã quan sát thêm rằng việc uống nước chiết xuất từ Lan gấm (A.formosanus) có thể kích hoạt các phản ứng miễn dịch của chuột, như kích thích sự gia tăng của các mô bạch huyết và kích hoạt quá trình thực bào của đại thực bào màng bụng chống lại Staphylococcus aureus. Nghiên cứu này gợi ý rằng hoạt động chống khối u của Lan gấm
(A.formosanus) có thể liên quan đến tác dụng kích thích miễn dịch mạnh mẽ của nó;
điều đó đáng để phân tích thêm thành phần điều hòa miễn dịch được tinh chế từ Lan gấm (A.formosanus) và đánh giá tiềm năng của nó giá trị cho việc điều trị các bệnh ung thư ở người.
Nghiên cứu của Shih CC và công sự (2005) [80] cho thấy dịch chiết của Lan gấm (A.formosanus) có tác dụng điều trị các bệnh gây tổn thương gan, cải thiện các thay đổi và thúc đẩy tái tạo tế bào gan, sử dụng trong điều trị xơ gan. Wu JB và cộng sự (2006) [93] nghiên cứu hợp chất Kinsenoside chiết xuất từ cây Lan gấm
(A.formosanus) có hoạt động mạnh nhất trong hoạt động ức chế viêm gan mạn tính
gây ra bởi CCl4 ở chuột. Zhang Y và cộng sự (2007) [104] cho biết hợp chất 3 (R)-3- β-Dglucopyranosyloxy butanolide có tên thương mại là Kinsenoside được chiết xuất từ các loài Lan gấm (A.formosanus), A.koshunensis và Kim tuyến tơ (A.setaceus) có giá trị dược liệu rất cao, những nghiên cứu thử nghiệm chất này đã được tiến hành trên chuột cho thấy có khả năng kháng khuẩn, chống tăng huyết áp, đặc biệt là khả năng bảo vệ gan. Trên mô hình gây độc cho tế bào gan BALB/c bởi H2O2 cho thấy, cho chuột uống kinsenosid làm tăng rõ rệt các giá trị LD50 của H2O2 so với mẫu đối
chứng. Carbontetrachloride (CCL4) là nguyên nhân gây viêm gan mãn, dẫn tới sự gia tăng hydroxyprolin trong gan, trọng lượng lá lách, hàm lượng GPT trong huyết thanh và làm giảm hàm lượng albumin trong huyết tương, những nghiên cứu cũng cho thấy sử dụng cao chiết từ Lan gấm (A.formosanus) có tác dụng ức chế viêm gan mãn tính gây ra bởi CCL4. Theo Lin WC (2007)[75], Lan gấm (A.formosanus) đã được sử dụng làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ thể và kháng virus cúm A; dịch chiết của chúngcó khả năng kháng virus, kháng sưng viêm, bảo vệ gan và tăng cường sức khỏe. Một nghiên cứu khác, Xiao – Ming Du (2008) [94] đã xác định được 10 hợp chất glycosidescủa cây Lan gấm (A.formosanus), trong đó quan trọng nhất là Kinenoside = (3R)-3-beta-D-glucopyranosyloxy butanolide; các glycosides khác gồm những hợp chất loại hydroxybutanoic acid, loại hydroxymethylfuran, loại gamma- lactone, ngoài ra còn có corchoionoside G... chúng hoạt động đáng kể trong việc giảm mức độ của các enzym cytosolic LDH, GOT, GPT; kết quả đã chứng minh rằng Lan gấm (A.formosanus) có tác dụng nổi bật chống lại ngộ độc gan; nghiên cứu lâm sàng trên 36 người tình nguyện có triglyceride và cholesterol cao, được điều trị với dịch chiết từ cây Lan gấm (A.formosanus) 450 mg/ngày, thời gian 6-12 tháng, cho thấy chúng có thể hoạt động như một hoạt chất của gan dẫn đến cải thiện lipid chuyển hóa.
Hsieh CC et.al, (2010)[61] nghiên cứu dịch chiết từ cây Lan gấm
(A.formosanus) có khả năng điều chỉnh bài tiết cytokine và tế bào T bằng cách điều
chỉnh sự xâm nhập của tế bào viêm và điều chỉnh phản ứng dị ứng trong hen suyễn dị ứng và làm tăng khả năng ức chế miễn dịch trong viêm phổi dị ứng và thâm nhiễm viêm đường hô hấp; nghiên cứu khác của Hsieh W.T et. al. (2011)[62] về hoạt chất Kinsenoside chiết xuất từ cây Lan gấm (A.formosanus) nuôi trồng tại nông trại Yu-Jung (Pu-Li, Đài Loan), thí nghiệm trên chuột cho thấy chúng có tác dụng bảo vệ đáng kể gan khỏi bị tổn thương, bằng cách giảm các hoạt động của aminotransferase huyết tương, giúp cải thiện cấu trúc mô học của gan. Kinsenoside ức chế hoạt hóa tế bào Kupffer bằng cách giảm các biểu hiện protein và mRNA CD14. Nghiên cứu sử dụng theo hướng mới lạ của loại thảo mộc truyền thống Châu Á của Chang-Chai Ng et. al (2011)[51] về Lan gấm (A.formosanus) như một loại thực phẩm truyền thống, thường được sử dụng để điều trị rối loạn gan, viêm gan,
tăng huyết áp, tiểu đường, rối loạn tim mạch, v.v. Trong đó nghiên cứu, rễ, thân và lá của chúng được sử dụng làm chất nền cho quá trình lên men lactic. Các sản phẩm lên men đã được phân tích về hoạt động chống oxy hóa tổng thể của chúng, giảm năng lượng và tác động thu hồi đối với các gốc anion superoxide và oxy già. Hoạt động chống oxy hóa của Lan gấm (A.formosanus) được tìm thấy là 61–78%. Nghiên cứu này có thể gợi ý một cách sử dụng mới của Lan gấm (A.formosanus)
lên men lactic trong sản xuất thực phẩm chức năng.
Theo Yen-Chou Kuan (2012) [98], Lan gấm (A.formosanus) là một loại dược liệu làm thuốc truyền thống của Trung Quốc, các chất chiết xuất Lan gấm
(A.formosanus) đã được báo cáo là có hoạt chất chống viêm và chống khối u ruột kết
ở chuột; tác giả cũng đã nghiên cứu loại protein mới được phân lập từ Lan gấm
(A.formosanus) có tác dụng điều hòa miễn dịch đối với đại thực bào phúc mạc của
chuột như một loại thuốc peptide tiềm năng (peptide - một thành phần có trong mỹ phẩm được nhiều tín đồ chăm sóc da săn lùng. Đây là hợp chất giúp sản sinh collagen duy trì sự đàn hồi cho da [63].
Từ minh chứng về đặc tính chống loãng xương và prebiotic của Lan gấm
(A.formosanus), Li-Chan Yang và cs (2013)[95] đã nghiên cứu các hoạt tính sinh
học của Lan gấm (A.formosanus) có tác dụng ngăn ngừa loãng xương ở chuột. Amaresh Panda và cs (2014)[45] nghiên cứu chỉ ra dịch chiết của Lan gấm
(A.formosanus) có chứa các anthraquinone glycosides, cardiac glycosides, reducing
sugars, carbohydrates, các hợp chất phenols, tannins, flavonoids and saponins và không có tính độc. Tác giả Li-Chan Yang (2014) [96] tìm ra hoạt chất
Arabinogalactan cấu trúc đặc trưng từ Lan gấm (A.formosanus) như một bộ điều
biến miễn dịch chống lại bệnh ung thư ruột kết ở chuột. Shyur LF và cộng sự (2015)[84] nghiên cứu hợp chất chiết xuất từ cây Lan gấm (A.formosanus) hoạt động gây độc trên các tế bào khối u, có liên quan đến sự cảm ứng của apoptosis (chu kỳ tự chết của tế bào), tương tự như các cách thức và cơ chế tác dụng apototic trên tế bào ung thư gây ra bởi thuốc chống ung thư. Một nghiên cứu nổi bật và quan trọng của Ching-Yi Lai (2015) [54] đã xác định được hoạt chất Type II
miễn dịch chống lại các tác nhân gây bệnh của vi sinh vật và các khối u. Đáng chú ý là công trình nghiên cứu chiết xuất dung dịch từ Lan gấm (A.formosanus) bào chế dược phẩm hữu ích cho bảo vệ gan” được cấp bằng sáng chế tại Mỹ, số US9072770 B2 (2015). Một số công dụng khác cũng được Teoh ES, et al; (2016) [85] chỉ ra từ xa xưa người dân địa phương ở các vùng núi hay các quần đảo của Đài Loan nơi có sự phân bố của các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) đã biết sử dụng các loài này để chữa rắn cắn, mất ngủ. Đánh giá hàm lượng dược tính, Nada Mohammed Reda Refish và cs (2016) [78] nghiên cứu cây Lan gấm (A.formosanus)
nuôi trồng 90 ngày tuổi có hỗ trợ của vi khuẩn Bacillus subtilis cho thấy hàm lượng flavonoid đạt 1,424%.
1.3.1.2. Tại Việt Nam
Phan Xuân Bình Minh (2019)[28] nghiên cứu xác định được 8 hợp chất từ loài Kim tuyến tơ (A. setaceus), trong đó có 2 hợp chất được bổ sung mới là adensine và roeoside. 6 hợp chất từ loài Kim tuyến trung bộ (A.annamensis), trong đó có 1 hợp chất mới là 4‟, 5- dihydroxy-3,3‟, 7- trimethoxyflavone 4‟-O-α-L- rhamnopyranosyl- (1→6)-β-Dglucopyranoside.
Từ những cơ sở khoa học nêu trên cho thấy một số loài thuộc chi Lan kim tuyến là cây thuốc quý được dân gian sử dụng từ lâu đời tại một số quốc gia (Trung Quốc, Đài Loan, Nhật bản,…),đặc biệt loài Lan gấm (A.formosanus) ở Đài Loan còn được mệnh danh là "Vua của Thuốc” (The King of Medicine)[99]có nhiều tác dụng, như: tăng cường miễn dịch, phòng chống ung thư, bệnh loãng xương, dùng trong chữa trị các chứng bệnh về gan, phổi, tiểu đường, viêm thận và kháng vi rút, hoạt chất bảo vệ gan đã được cấp 2 bằng sáng chế tại Mỹ [88,89],…vì vậy, luận án lựa chọn Lan gấm (A.formosanus) để nghiên cứu nhân giống In vitro, nuôi trồng cung cấp dược liệu, qua đó giúp lưu giữ nguồn gen trong phòng thí nghiệm và bảo
tồn ở điều kiện chuyển chỗ (ex situ); lựa chọn nghiên cứu hàm lượng flavonoid [78]
tổng số làm cơ sở so sánh, đánh giá hiện diện dược tính của Lan gấm (A. formosanus) nuôi trồng với một số loài đã được nghiên cứu.
1.4. Tình hình n h cứ đố vớ o La ấm (A.fomosanus)
1.4.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống Lan gấm
1.4.1.1. Trên thế giới
Công tác nghiên cứu nhân giống với loài Lan gấm (A.fomosanus) phải kể đến công trình nghiên cứu của tác giả Yih-Juh Shiau et.al (2001) [81] với phương pháp nhân giống hàng loạt Lan gấm (A.formosanus) bằng cách thụ phấn nhân tạo chéo và cho hạt nảy mầm bất cộng sinh. Sự thành công của quá trình thụ phấn và đậu trái phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của thể giao tử đực và cái. Cho cây ra hoa giao phấn với tỷ lệ đậu quả quả là 86,7%. Hạt từ nang 7 tuần tuổi cho nảy mầm bằng cách nuôi cấy trên môi trường ½ Murashige và Skoog’s (MS) có bổ sung 0,2% than hoạt tính và 8% dịch chuối trong bốn tháng. Cây con nảy mầm được nuôi cấy trong môi trường 1/2MS lỏng, môi trường chứa 2 mg/l N6-benzyladenine (BA) trong bình Erlenmeyer 125 ml trong 2 tháng. Cây con có thân rễ và chồi phát triển tốt được nuôi cấy trên 1/2MS, môi trường với 0,2% than hoạt tính, 8% dịch chuối, 2 mg / l BA và 0,5 mg/l a-naphthaleneacetic axit (NAA), kết quả khoảng 90% cây có nguồn gốc từ hạt sống sót sau 2 tháng khi chuyển sang trồng trên giá thể rêu than bùn.
Nghiên cứu của Fu-sheng Zhang và cs (2013) [102], sử dụng môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) và bổ sung 0,5 mg / L naphthaleneacetic acid (NAA), 1 mg / L 6-benzyl adenine (6BA), 1 g / L than hoạt tính và 30 g / L sucrose để sản xuất Lan gấm (A.formosanus) quy mô lớn nhằm bảo vệ quần thể hoang dã của loài lan quý hiếm và bị đe dọa này; các kết quả chứng minh rằng Lan gấm
(A.formosanus) duy trì độ trung thực di truyền cao ngay cả sau khi nhân giống trong
ống nghiệm 5 năm.
1.4.1.1. Tại Việt Nam
Nguyễn Văn Kết và cs (2003, 2004)[68,69] nghiên cứu nhân giống in vitro,
sử dụng 3 môi trường khoáng cơ bản là Murashige and Skoog (1962, MS), Knudson (1946, KC) and modified Hyponex (Kano 1965; H3), cho thấy MS (3,2 chồi/mẫu; 3,6cm/chồi) và H3 (2,0 chồi/mẫu; 3,7 cm/chồi) là thích hợp hơn môi trường KC (1 chồi/mẫu; 2,4cm/chồi) đối với sự tái sinh và sinh trưởng chồi Lan gấm
(A.formosanus). Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) +
Môi trường MS bổ sung 1mg/l BA (5,10 chồi/mẫu, chiều cao chồi 3,62 cm, khối lượng tươi 0,26 g/mẫu) hoặc 1mg/l Kinetin (4,60 chồi/mẫu, chiều cao chồi 3,40 cm, khối lượng tươi 0,32 g/mẫu) là tốt nhất đến sự tái sinh và sinh trưởng chồi sau 60 ngày nuôi cấy và khảo sát các nồng độ than hoạt tính và nồng độ sucrose thì môi trường MS bổ sung 1-2g/l than hoạt tính (chiều cao cây 4,19-4,2 cm, số rễ 2,20- 2,70 rễ/cây, chiều dài rễ 1,45-2,50 cm, tỉ lệ tái sinh rễ đạt 100%), môi trường bổ sung 15-30 g/l suclose (chiều cao cây 4,18-4,30 cm, số rễ 2,30-2,80 rễ/cây, chiều dài rễ 1,84-2,85 cm, tỉ lệ tái sinh rễ đạt 100%) là thích hợp cho sự tái sinh rễ và sinh trưởng của chồi cây in vitro sau 50 ngày nuôi cấy của tác giả Phan Xuân Huyên, Vũ Thị Hà (2015)[22] Phan Xuân Huyên và cộng sự (2018)[25]. Một nghiên cứu khác của Phan Xuân Huyên, Nguyễn Thị Phượng Hoàng (2017)[24] cũng chỉ ra nhân giống in vitro Lan gấm (A.formosanus) ở môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA, 50 g/l dịch chuối, 1 g/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose, 9 g/l agar, pH 5,8 là tốt nhất cho phép tái sinh chồi in vitro, với 5,20 chồi/mẫu, chiều cao chồi 3,38 cm, khối lượng tươi 0,26 g/mẫu. Mẫu mang một đốt thân là nguồn vật liệu thích hợp nhất trong nhân giống in vitro. Vị trí đốt thân thứ hai đến thứ sáu là nguồn vật liệu thích hợp nhân giống in vitro. Nồng độ IBA từ 0 – 1 mg/l đều thích hợp cho phép tái sinh rễ
in vitro, với tỉ lệ 100%. Vụn xơ dừa là giá thể tốt nhất cho phép thích nghi của cây
con, với tỉ lệ sống đạt 100%, chiều cao cây 5,82 cm, chiều dài rễ 3,64 cm (cây 02 tháng). Tác giả Nguyễn Thị Lệ Hà (2017) [18] đã tiến hành khử trùng bằng Javel 30%, trong 20 phút đạt tỷ lệ mẫu Lan gấm (A.formosanus) sống cao nhất (50%), môi trường phù hợp để nhân chồi là MS có bổ sung 1 mg/l BA, môi trường thích hợp để kéo dài chồi là MS có bổ sung 0,3 mg/l BA + 0,3 mg/l NAA, số rễ hình