2.3.8.1. Nhân giống in vitro
Được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm nghiệp và Trung tâm nghiên cứu, ứng dụng khoa học công nghệ Lâm nghiệp Thanh Hoá. Thời gian từ ngày 26/7/2017 đến ngày 25/8/2018.
Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp vô trùng. Phòng nuôi được duy trì cường độ chiếu sáng 2000-3000lux, thời gian chiếu sáng 10 -14 h/ngày, nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20C. Các thao tác với mẫu được thực hiện trong tủ cấy vô trùng, môi trường và các dụng cụ như panh, kéo, đĩa cấy, nước cất được khử trùng trước khi sử dụng trong nồi hấp với áp suất 1 atm, 1210
C trong 20 phút.
* Vật liệu nhân giống: Là những đoạn thân khí sinh hoặc thân ngầm của cây
* Xác định công thức khử trùng mẫu
Tiến hành rửa cây Lan gấm (A.formosanus) dưới vòi nước sạch, tiếp đến rửa bằng dung dịch xà phòng loãng và tiếp tục rửa lại bằng nước sạch. Vật liệu sau khi tiến xử lý sạch sẽ được đưa vào tủ cấy vô trùng và được khử trùng bằng các loại hoá chất khác nhau, như: HgCl2 0,1% với thời gian 3 phút (CT1), 5 phút (CT2), 7 Phút (CT3) và 9 phút (CT4) (tiến hành khử trùng 2 lần ở các công thức CT2, CT3, CT4, công thức CT1 chỉ khử trùng 1 lần do thời gian khử trùng ngắn). Việc khử trùng hai lần có tác dụng làm giảm sự xâm nhập sâu của hóa chất khử trùng vào trong mẫu vật liệu, tránh gây tổn thương và giảm sức sống của mẫu vật liệu nhân giống. Sau mỗi lần khử trùng bằng HgCl2 0,1% mẫu vật liệu nhân giống đều được rửa lại bằng nước cất vô trùng (2-3 lần) để loại bớt tính độc hại của hóa chất khử trùng. Thân Lan gấm (A.formosanus) sau khử trùng được cắt thành những đoạn 3-4cm (mang 1-2 chồi ngủ) hoặc chồi ngọn được cấy vào môi trường MS bổ sung + 30g/l đường sucrose + 7g/l agar + 0,5mg/l BAP.
Thí nghiệm bố trí 30 đoạn mang chồi ngủ (nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 đoạn). Hàng ngày quan sát, loại bỏ các mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn (nếu có), sau 4 tuần vào mẫu tiến hành đo đếm với các chỉ tiêu số mẫu sạch và số mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi.
* Nhân nhanh chồi
- Nghiên cứu môi trường khoáng thích hợp cho tạo đa chồi:
Chồi in vitro sạch tái sinh trên môi trường vào mẫu được cắt thành đoạn 1,5- 2cm và được cấy sang các môi trường khoáng khác nhau (1/2 MS, MS, Knud*) cùng bổ sung 0,5mg/l BAP + 30g/l đường sucrose + 7,0g/l agar.
Thí nghiệm bố trí mỗi môi trường tiến hành cấy 30 đoạn mẫu (nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 đoạn). Kết quả đo đếm đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy với các chỉ tiêu, gồm: Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi, số chồi trung bình trên mẫu, chiều cao trung bình của chồi và đánh giá chất lượng chồi dựa vào màu sắc lá, độ mập của chồi.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo đa chồi: Chồi in vitro sạch tái sinh trên môi trường vào mẫu được cắt thành đoạn 1,5- 2cm và được cấy sang môi trường MS + 30g/l đường sucrose + 7,0g/l agar + bổ
sung kết hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP (0,5 và 0,7 mg/l) với kinetin (0,2 và 0,3 mg/l) và NAA (0,1 và 0,3 mg/l), công thức thí nghiệm bố trí theo bảng 2.4.
B 2.4 Cô hức hí h ệm h hưở của các chấ đ ề hòa s h ưở kh ă ạo đa chồ
Cô hức hí h ệm
Chấ đ ề hòa s h ưở (m / )
BAP Kinetin NAA
ĐC - - -
MS1 0,5 0,3 0,3
MS2 0,5 0,3 0,1
MS3 0,7 0,2 0,3
MS4 0,7 0,2 0,1
Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành cấy 30 đoạn mẫu (nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 đoạn). Kết quả đo đếm đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy với các chỉ tiêu, gồm : Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi, số chồi trung bình/mẫu, chiều cao trung bình của các chồi và chất lượng chồi (tốt, TB, xấu).
* Tạo cây hoàn chỉnh
Chồi in vitro đạt tiêu chuẩn có kích thước từ 3-4 cm được chuyển sang môi trường ra rễ MS và 1/2 MS, có bổ sung NAA với các nồng độ 0,5 mg/l; 1,0 mg/l và 1,5 mg/l + 20g/l đường sucrose + 7g/l agar + 2g/l than hoạt tính, bố trí công thức thí nghiệm tại bảng 2.5.
B 2.5 Cô hức hí h ệm h hưở của NAA đế ạo câ ho chỉ h Cô hức Mô ườ NAA (mg/l)
R1 1/2 MS 0,5 R2 1/2 MS 1,0 R3 1/2 MS 1,5 R4 MS 0,5 R5 MS 1,0 R6 MS 1,5
Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành cấy 30 chồi (chia thành 3 lần nhắc lại mỗi lần 10 chồi). Kết quả đo đếm đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy với các chỉ tiêu, gồm : Số cây ra rễ, số lượng rễ và chiều dài trung bình của các rễ, đánh giá chất lượng cây con dựa vào hình thái của cây (tốt, trung bình, xấu).
* Ra cây mô ngoài vườn ươm trên các giá thể khác nhau
Cây mô đạt tiêu chuẩn (cao khoảng 4-5 cm, thân lá cứng cáp, có rễ hoàn chỉnh), bệnh được chuyển ra huấn luyện 1 tuần trong điều kiện ánh sáng tán xạ.
Lấy cây ra khỏi bình, rửa cây bằng nước sạch. Khi trồng nhúng phần gốc của cây giống vào dung dịch NAA, nồng độ 4.000 ppm, tương ứng 0,4% hay 4g/lít nước, trong thời gian khoảng 3-5 giây để kích thích ra rễ.
Cây được trồng trên ba loại giá thể khác nhau, là: Cát vàng, xơ dừa và rêu khô, phun thuốc sát khuẩn Physan nồng độ 12ml với 18l nước để diệt trừ mầm bệnh. Khay trồng bằng nhựa có kích thước 40 x 60 cm được rải một lớp giá thể dày 5cm. Bố trí thí nghiệm: 30 cây với 3 lần nhắc.
Điều kiện chăm sóc: Che sáng 70% bằng lưới đen và tưới nước phun sương giữ ẩm 2-3 lần/ngày tùy điều kiện thời tiết.
Sau 8 tuần chăm sóc, mức độ ảnh hưởng của loại giá thể lên sự sống và sinh trưởng của cây mô Lan gấm (A.formosanus) được đánh giá thông qua các chỉ tiêu : Số cây sống, chiều cao, đường kinh thân, mô tả đặc điểm cây.
Sau khi hoàn thiện kỹ thuật nhân giống in vitro tiến hành nhân 1.000 cây để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo của luận án.
2.3.8.2. Nghiên cứu kỹ thuật trồng Lan gấm
Do phạm vi phân bố tự nhiên của loài Lan gấm (A.formosanus) chỉ ghi nhận tại KBT các loài hạt trần quý hiếm Nam Động (Thanh Hóa), KBT có diện 502,84 ha hiện đang được bảo tồn nghiêm ngặt, do vậy luận án không đi vào nghiên cứu bảo tồn nguyên vị (in situ) mà tiếp cận với hướng nghiên cứu bảo tồn ngoại vi (ex situ) thông qua nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô để có hệ số nhân giống cao. Về trồng Lan gấm (A.formosanus), ở một công trình nghiên cứu khác NCS đã thực hiện trồng thành công trên núi cao 800-900m (đề tài KHCN thuộc chương trình quỹ gen, mã số: NVQG-2016/07), vì vậy luận án với hướng tiếp cận
mới là “nghiên cứu trồng tại khu vực ven khe suối có tiểu khí hậu mát, gắn với quy hoạch phát triển du lịch sinh thái thác Thiên Thủy thuộc Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên” để khai thác nguồn gen cung cấp nguyên liệu dược, đồng thời góp phần bảo tồn nguồn gen loài Lan gấm (A.formosanus).
a) Nghiên cứu kỹ thuật trồng trong nhà lưới
Tiến hành nghiên cứu nhằm xác định giá thể trồng, mật độ trồng, loại phân bón và thời vụ trồng phù hợp. Các Thí nghiệm được tiến hành trong thời gian 12 tháng, từ ngày 01/9/2018 đến 30/10/2019.
- Cây giống: Từ nguồn cây giống Lan gấm (A.formosanus) nhân bằng phương pháp nuôi cấy mô. Quy cách: Cây cao khoảng 5-6 cm, thân lá cứng cáp, có từ 3 lá trở lên, có rễ mọc ra từ mấu mắt của gốc thân, khỏe mạnh, sạch bệnh.
- Bố trí thí nghiệm như sau:
* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng đến khả năng sinh trưởng của Lan gấm (A.formosanus)
Công thức: 5 CT, 1) Rêu khô; 2) Xơ dừa (xơ dừa được xay xé nhỏ, phơi khô, xử lý bằng cách ngâm trong nước vôi trong 48 giờ, sau đó ngâm lại bằng nước sạch 24 giờ, vớt ra để ráo); thân, rễ dương xỉ, tổ quạ (xay xé nhỏ); giá thể 1/3 sơ dừa ủ hoai, 1/3 đất mùn và 1/3 phân chuồng ủ hoai và cát vàng.
Rải một lớp giá thể dày khoảng 5cm vào khay, phun thuốc sát khuẩn Physan nồng độ 12ml với 18l nước để diệt trừ mầm bệnh.
Khi trồng nhúng phần gốc của hom giống vào dung dịch NAA, nồng độ 4.000 ppm, tương ứng 0,4% hay 4g/lít nước, trong thời gian khoảng 3-5 giây để kích thích ra rễ.
Đặt cây giống lên giá thể theo hàng, khoảng cách các hom 5cm x 5 cm, sau đó phủ một lớp mỏng giá thể lên trên cây cây giống, lưu ý: không phủ giá thể lấp lá hom giống.
Bố trí thí nghiệm: 30 cây/CT với 3 lần nhắc. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 03 tháng.
* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ trồng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Lan gấm
Công thức: 3 CT (cây cách cây 5cm, hàng cách hàng 5cm; cây cách cây 10cm, hàng cách hàng 10 cm; cây cách cây 15 cm, hàng cách hàng 15 cm).
Giá thể: Sử dụng rêu khô. Rải một lớp giá thể dày khoảng 5cm vào khay, phun thuốc sát khuẩn Physan nồng độ 12ml với 18l nước để diệt trừ mầm bệnh.
Trước khi trồng, nhúng phần gốc của cây giống vào dung dịch NAA, nồng độ 4.000 ppm, tương ứng 0,4% hay 4g/lít nước, trong thời gian khoảng 3-5 giây để kích thích ra rễ.
Bố trí thí nghiệm: 30 cây/CT với 3 lần nhắc. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 03 tháng.
* Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại phân bón qua lá đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Lan gấm (A.formosanus).
Công thức: 5 CT (Phân VINASUBOR (pha tỷ lệ 100ml với 30lít nước), Grow More (NPK:30-10-10), N – P – K, tỷ lệ 1:1:1; phân HVP (NPK:30-10-10) và Không bón phân (đối chứng)).
Khoảng cách trồng: Cây cách cây 5cm, hàng cách hàng 5cm.
Giá thể: Sử dụng rêu khô. Rải một lớp giá thể dày khoảng 5cm vào khay, phun thuốc sát khuẩn Physan nồng độ 12ml với 18l nước để diệt trừ mầm bệnh.
Trước khi trồng, nhúng phần gốc của cây giống vào dung dịch NAA, nồng độ 4.000 ppm, tương ứng 0,4% hay 4g/lít nước, trong thời gian khoảng 3-5 giây để kích thích ra rễ.
Bố trí thí nghiệm: 30 cây/CT với 3 lần nhắc. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 03 tháng.
Số lần bón phân 2 lần: Lần 1 phun sau khoảng 3-4 tuần sau khi trồng, lần sau phun cách lần 1 là 20 ngày.
* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Lan gấm (A.formosanus)
Công thức: 4CT, trồng cây vào các mùa khác nhau trong năm: Mùa Xuân, mùa Hạ, mùa Thu và mùa Đông.
Cây được trồng trong nhà lưới đơn giản có mái che bằng nilong cắt nắng 70%, xung quanh vây lưới chắn côn trùng bảo vệ cây trồng; trồng cây trên giá thể
rêu khô đã được xử lý mầm bệnh (bằng cách phun thuốc sát khuẩn Physan 20SL, liều lượng 12ml/18l nước).
Giá thể: Sử dụng rêu khô. Rải một lớp giá thể dày khoảng 5cm vào khay, phun thuốc sát khuẩn Physan nồng độ 12ml với 18l nước để diệt trừ mầm bệnh.
Trước khi trồng, nhúng phần gốc của cây giống vào dung dịch NAA, nồng độ 4.000 ppm, tương ứng 0,4% hay 4g/lít nước, trong thời gian khoảng 3-5 giây để kích thích ra rễ.
Thực hiện chăm sóc (tưới phun sương giữ ẩm 2 - 3 lần/ngày tùy điều kiện thời tiết; định kỳ 01 tháng/lần phun thuốc sát khuẩn Physan 20SL (liều lượng 12ml/18l nước) để phòng bệnh; định kỳ 01 tuần/lần phun phân sinh học VINASUBOR (bón phân 2 lần: Lần 1 phun sau khoảng 3-4 tuần sau khi trồng, lần sau phun cách lần 1 là 20 ngày, pha theo hướng dẫn của nhà SX rồi phun).
Bố trí thí nghiệm: 30 cây/CT với 3 lần nhắc. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 03 tháng.
- Kết thúc các thí nghiệm nêu trên, lựa kết quả tốt nhất để trồng thực nghiệm Lan gấm (A. fomorsanus) hoàn thiện kỹ thuật và đánh giá thành phần dược tính của cây Lan gấm (A. fomorsanus) nuôi trồng trong nhà lưới. Thời gian trồng thực nghiệm 12 tháng.
Bố trí thí nghiệm: 30 cây/CT với 3 lần nhắc. b) Nghiên cứu kỹ thuật trồng dưới tán rừng
Nghiên cứu nhằm xác định đối tượng rừng phù hợp để trồng Lan gấm
(A.formosanus) dưới tán rừng. Thí nghiệm được tiến hành trong thời gian 3 tháng,
từ ngày 25/10/2018 đến 30/01/2019.
- Cây giống: Từ nguồn cây giống Lan gấm (A.formosanus) nhân bằng phương pháp nuôi cấy mô. Quy cách: Cây cao khoảng 5-6 cm, thân lá cứng cáp, có từ 3 lá trở lên, có rễ mọc ra từ mấu mắt của gốc thân, khỏe mạnh, sạch bệnh.
- Bố trí thí nghiệm như sau:
+ Công thức: 4 CT (1) Rừng trồng gỗ Keo; 2) Rừng trồng Luồng, tại lô 6, Khoảnh 14, TK 440, thuộc xã Thúy Sơn, huyện Ngọc Lặc, tỉnh Thanh Hóa, độ cao 120m; 3) Rừng gỗ tự nhiên (trạng thái IIIa3); 4) Rừng tự nhiên hồn giao gỗ - tre nứa
(IIIa3 – NIII), tại Lô 2, Khoảnh 5b, Tiểu khu 520 thuộc xã Vạn Xuân, huyện Thường Xuân, tỉnh Thanh Hóa, độ cao 300m.
Trước khi trồng, nhúng phần gốc của cây giống vào dung dịch NAA, nồng độ 4.000 ppm, tương ứng 0,4% hay 4g/lít nước, trong thời gian khoảng 3-5 giây để kích thích ra rễ.
Trồng cục bộ ở các khoảng trống trong rừng nơi đất ẩm ướt; cây bụi, thảm tươi thưa thớt. Dùng dụng cụ (như bay cầm tay) xới lổ sâu 1-2cm; đặt phần gốc cây giống vào lổ, phần mang lá cao hơn miện lổ trồng, lấp đất lên phần thân cây cho đầy miệng lỗ. Phương thức trồng cục bộ 3 cây/cụm, nhằm tăng khả năng tồn tại khi trồng ngoài rừng (tránh lá cây rơi rụng làm che lấp hoàn toàn cụm cây), lựa chọn cự ly bình quân giữa các cây trong cụm 10- 20 cm; cự ly bình quân giữa các cụm là 0,5 m x 0,5m
Chăm sóc: Tưới nước giữ ẩm mặt đất vào mùa nắng nóng (mùa hè) và khô hanh (mùa đông), 01 lần/tuần.
Bố trí thí nghiệm: 30 cây/CT với 3 lần nhắc. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 03 tháng.
- Kết thúc thí nghiệm nêu trên, lựa kết quả tốt nhất để trồng thực nghiệm Lan gấm (A.fomorsanus) hoàn thiện kỹ thuật và đánh giá thành phần dược tính của cây Lan gấm (A.fomorsanus) nuôi trồng dưới tán rừng. Thời gian trồng thực nghiệm 12 tháng.
Bố trí thí nghiệm: 30 cây/CT với 3 lần nhắc.
Chăm sóc: Tưới nước giữ ẩm mặt đất vào mùa nắng nóng (mùa hè) và khô hanh (mùa đông), 01 lần/tuần.
2.3.8.3. Phương pháp đo đếm sinh trưởng, theo dõi sâu bệnh hại ở các thí nghiệm
* Phương pháp đo đếm sinh trưởng:
Số cây sống hiện tại
- Tỷ lệ sống: Tls (%) = x 100
Số cây trồng ban đầu - Đo chiều cao:
+ Cây ở vườn ươm, trong các thí nghiệm và ở nhà lưới: Đo chiều cao từ mặt giá thể đến ngọn cây.
+ Cây ở dưới tán rừng: Đo chiều cao từ mặt đất đến ngọn cây + Tính chiều cao bình quân:
H1 + H2 + H3 +...Hn
Công thức tính: H = (cm)
N
Trong đó: Hn là chiều cao của thân cây thứ n; N Là toàn bộ số cây đã đo chiều cao
- Đo đường kính:
+ Cây trong bình chồi đo tại gốc cây.
+ Cây ở vườn ươm đo sát mặt giá thể, mặt đất. + Tính đường kính bình quân:
D1 + D2 + D3 +...Dn Công thức tính: D = (mm)
N
Trong đó: Dn là đường kính của thân cây thứ n; N Là toàn bộ số cây đã đo đường kính.
- Đo chiều dài rễ: Từ mấu mắt đến hết chiều dài rễ (đo 1 lần khi kết thúc thí nghiệm).
- Tần suất theo dõi đo đếm chỉ tiêu sinh trưởng các thí nghiệm: Định kỳ 07 ngày/lần vào cùng thời điểm (buổi sáng từ 8h), đo đếm 30 cây (lựa chọn ngẫu nhiên rồi định vị cây để đo đếm trong suốt thời gian thí nghiệm).
- Tần suất theo dõi đo đếm chỉ tiêu sinh trưởng mô hình: Định kỳ 01 tháng/lần vào cùng thời điểm (buổi sáng), đo đếm 30 cây (lựa chọn ngẫu nhiên rồi định vị cây