Trong các lớp chất có hoạt tính sinh học cao từ rong biển thì lipit được nghiên cứu khá nhiều do trong thành phần lipit của rong biển có chứa nhiều axit béo thiết yếu đặc biệt là các axit béo không no nhiều nối đôi (PUFA – PolyUnsaturated Fatty Acid), các axit béo này được xác định như một thành phần đặc trưng cho rong biển. Chính các axit béo PUFA này là những chất chính thể hiện hoạt tính sinh học của lipit, trong đó quan trọng nhất là các axit béo thuộc họ Omega3 (hay n-3) và họ Omega6 (hay n-6) [1,18,22,23].
Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, hàm lượng lipit chiếm từ 1-10% trọng lượng khô của rong Đỏ. Vanessa Gressler và cộng sự khi nghiên cứu thành phần sinh hoá của một số loài rong Đỏ thu ở vùng biển Brasil đã xác định được hàm lượng lipit tổng đạt từ 1,1-6,2% so với trọng lượng khô của rong. Nor Salmi Abdullah công bố xác định hàm lượng lipit của rong Câu Gracilaria manilaensis
chiếm đến 2% trọng lượng khô.
Khotimchenko S.V., Svetashev V. I. (1991) đã xác định thành phần các axit béo của một số loài rong Đỏ. Đáng chú ý là axit béo eicosapentaenoic axit (EPA) và axit arachidonic (AA). Khi nghiên cứu về thành phần axit béo ở rong Đỏ, Lovern (1985) đã tìm được các loại axit béo không no C20 và C22 (tương ứng với động vật biển về số lượng) [22,23].
Nghiên cứu của Khotimchenko (1983) trên 155 loài rong biển Nhật Bản cũng cho thấy, các axit không no nhiều nối đôi mạch >18C chiếm đến 37% trong rong Nâu và rong Lục, trong đó chủ yếu là palmitic, oleic, linoleic chiếm hơn 15%. Thành phần định tính ít thay đổi nhưng thành phần định lượng thay đổi theo loài, các tác giả Jaimieson, Reid (1972), Ackman, Mc Lashion (1974) cũng có cùng quan điểm đó [22].
Các tác giả Orcutt D.M & Patterson (1975); Monero (1979); Ben-Amotz A (1985); Yuvera (1984); Brows (1989); Volkman J.K. (1989-1993); Aknin M (1992) đã nghiên cứu thành phần và hàm lượng các axit béo có hoạt tính sinh học cao trong
26
các loài Đỏ trong đó phát hiện các axit béo không no nhiều nối đôi có mạch cacbon từ C16 đến C22.
Các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam trong những năm gần đây về dầu rong biển thì hàm lượng lipit tổng khoảng 1-6% trọng lượng khô. Nếu sử dụng rong biển để chiết dầu rong thì hiệu quả kinh tế chưa cao, gây lãng phí nguồn tài nguyên thiên nhiên này. Chính vì vậy, nghiên cứu quy trình kép vừa tách dầu rong (chứa axit arachidoninc) vừa tạo sản phẩm agar sẽ tận dụng triệt để nguồn rong biển, vừa đạt hiệu quả kinh tế cao.
27
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu rong câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata
- Kí hiệu mẫu: T28
- Thời gian thu mẫu: 8/ 11/2011
- Địa điểm thu mẫu: Phù Long – Cát Hải – Hải Phòng
Mẫu được định tên khoa học bởi TS. Đàm Đức Tiến – Viện Tài nguyên và Môi trường biển. Tiêu bản được lưu trữ tại Viện Tài nguyên và Môi trường biển, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hình 2.1: Rong câu Gracilariaten tenuistipitata thu tại vùng biển phía Bắc Việt Nam 2.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.2.1. Thiết bị nghiên cứu
- Máy sắc ký GC FINNIGAN Trace GC ultra – Gemany - Máy cô quay chân không EYELA N-1200ª
28
- Máy ly tâm MIKRO 220R Hettich- Zentrifugen - Máy siêu âm.
- Cân phân tích XT 220ª Precisa. - Thiết bị nấu, lọc agar.
- Hệ thống bảo quản mẫu.
- Một số thiết bị thiết yếu trong phòng thí nghiệm.
2.2.2. Hóa chất nghiên cứu
- Dung môi sử dụng để xử lý nguyên liệu methanol, ethanol, aceton, chloroform….
- Na2SO4, CH3ONa, NaOH, H2SO4
- Các hóa chất dùng trong phân tích Na2SO4, CH3ONa, NaOH, H2SO4....
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu rong câu chỉ vàng
Việc thu mẫu ở vùng triều dựa vào quy phạm tạm thời điều tra tổng hợp biển (phần rong biển) của Uỷ ban Khoa học và Kĩ thuật Nhà nước ban hành năm 1981[29]. Khảo sát vùng dưới triều dựa vào tài liệu hướng dẫn của Wilkinson & Baker 1997 bằng thiết bị lặn SCUBA, máy chụp ảnh dưới nước hiệu OLYMPUS kĩ thuật số (sản xuất tại Nhật Bản)[56].
Mẫu bảo quản hoặc làm tiêu bản sau khi thu, được ngâm trong dung dịch formol 5%. Mẫu khô (tiêu bản) được đặt trên giấy Croki sau đó ép trong giấy thấm.
Mẫu nghiên cứu hóa-sinh, sau khi thu (khoảng 2 kg rong tươi) được rửa sạch bằng nước mặn sau đó rửa bằng nước ngọt và bảo quản ngay trong nhiệt độ 4OC (ngoài thực địa bảo quản bằng túi bảo quản lạnh hoặc đá khô, trong phòng thí nghiệm bằng tủ bảo ôn SANAKY sau đó bảo quản bằng tủ lạnh sâu ở -20OC và - 47OC).
Mẫu thành phần loài được phân tích trong phòng thí nghiệm của Phòng Sinh thái và Tài nguyên Thực vật Biển (Viện Tài nguyên và Môi trường Biển).Việc định loại chủ yếu dựa vào các tiêu chuẩn về hình thái ngoài và cấu tạo trong (bằng các tiêu bản lát cắt dưới kính hiển vi Leica với độ phóng đại 1350 lần). Việc phân loại
29
rong biển tuân theo nguyên tắc chung phân loại thực vật. Tài liệu định loại căn cứ vào các tác giả như: Okamura, Taylor (1960), Segawa (1962), Phạm Hoàng Hộ (1969), Tseng (1993), Nguyễn Hữu Dinh và nnk., (1993), Tseng và nnk (2000), Yoshida (1998), Tseng and al. (2000) [2,6,21]
2.3.2. Phương pháp xác định hàm ẩm
Xác định hàm ẩm của rong theo phương pháp sấy khô [25]:
Thực nghiệm: sấy cốc cân sạch và để trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến trọng lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân mo(g). Cho 10g rong vào cốc, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng lượng cốc cân và mẫu là m1(g).
Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105oC, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy.Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2(g)
Kết quả tính độ ẩm: (W) W = (m1 – m2) x 100 % (m1 – m0) Trong đó:
mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy
m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.
2.3.3. Xác định hàm lượng lipit tổng
Theo phương pháp của E.G Bligh và W.J Dyer 1959 [32]. Phương pháp đã được xây dựng, cải tiến phù hợp với điều kiện Việt Nam tại phòng Hóa sinh hữu cơ – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
30
Thực nghiệm: Cân 100 gam mẫu rong biển tươi, nghiền nhỏ bằng máy xay, chiết bằng 300ml hệ dung môi CHCl3:CH3OH tỉ lệ 1:2, siêu âm trong 6 giờ. Bổ sung 100ml CHCl3, thêm 100 ml nước cất, lắc đều để phân lớp sau đó lấy phần dung dịch ở phía dưới, rửa lại bằng nước cất 2 lần rồi làm khan bằng Na2SO4. Dịch chiết được cô cất loại dung môi trên máy quay cất chân không ở 40oC, áp suất 25mmHg thu được hỗn hợp lipit tổng. Cân bằng cân phân tích Sartorius analytic (độ chính xác 10- 4g) và được tính theo phần trăm so với khối lượng rong ban đầu (phương pháp chiết được lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình) [32].
H (%) =
m x 100
% M
Trong đó:
H (%): hàm lượng lipit tổng có trong rong M: khối lượng rong ban đầu đem chiết m : khối lượng lipit tổng thu được.
2.3.4. Xác định thành phần và hàm lượng các axit béo có trong dịch lipit tổng
Theo tiêu chuẩn ISO/FDIS 659:1998 [10]. Các axit béo được metyl hóa và xác định thành phần và hàm lượng, phân tích trên máy sắc kí khí GC hãng Thermo Finnigan Italia S.P.A. TRACE GC Ultra series tại Phòng Hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên [10].
Thực nghiệm: Lấy 10mg hỗn hợp Lipit tổng được hòa tan với 1ml n-hexan trong lọ nhỏ nút kín, bổ sung 25ml dung dịch CH3ONa 30% và lắc kỹ trong 1 phút. Thêm vào 20mg Na2SO4 loại sạch, lắc kỹ và đem ly tâm ở chế độ 5000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch trong, sạch ở pha trên được tách riêng, kiểm tra trên sắc ký bản mỏng (TLC) [10]. Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 105715), RP18, F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc
31
dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ cho đến khi hiện màu.
Tiến hành phân tích trên máy sắc kí khí GC, cột mao quản Supelco Wax 10, (30m x 0,25mm x 0,25µm), chương trình nhiệt độ: 2000C trong 10 phút, tăng nhiệt độ từ 200 đến 2300C trong thời gian 5 phút, giữ ở nhiệt độ 2300C trong 10 phút, khí mang He. Nhận dạng axit béo bằng phần mềm nhận dạng chuyên dụng, tính toán chuyển đổi qua giá trị thời gian lưu tương đương ECL cho cột mao quản chuyên dụng có sử dụng hệ chất chuẩn là các axit béo C16:0 và C18:0. Kết quả tính theo công thức: 16:0 18:0 16:0 2 lg lg 16 lg lg x RT T ECL RT RT
2.3.5. Phương pháp thu nhận axit arachidonic từ loài rong câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata Gracilaria tenuistipitata
Thu nhận axit arachidonic được tiến hành theo các bước sau:
Bước 1: Chiết lipit tổng số
Rong câu thu ở Cát Hải – Hải Phòng (1kg) được rửa sạch, cắt nhỏ và cho vào bình thủy tinh 5 lít, bổ sung 4 lít dung môi CHCl3/CH3OH 1:2 (V/V) ngâm chiết dịch trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó rút toàn bộ dịch. Bổ sung 1,3 lít CHCl3, tiếp tục ngâm trong 24 giờ. Gom 2 phân đoạn thu được và rửa nước 2 lần, sau đó làm khan bằng Na2SO4. Quay cất loại dung môi, thu lipit tổng.
Bước 2: Thuỷ phân lipit tổng
Từ nguyên liệu dầu rong câu chỉ vàng (lipit tổng), chúng tôi tiến hành thủy phân dầu nhằm thu được hỗn hợp tổng các axit béo ở dạng tự do, tạo điều kiện thuận lợi cho giai đoạn làm giàu axit không no bằng cách tách các axit béo no và không no. Quá trình thủy phân sử dụng NaOH và dung môi là etanol. Điều kiện tiến hành phản ứng thủy phân như sau: Thời gian 120 phút; Nồng độ cồn 70%; Nhiệt độ 750C [3]. Sơ đồ quy trình thủy phân được thực hiện như sau:
32
Sơ đồ 2.1: Quy trình thủy phân lipid tổng
NaOH 5%/C2H5OH 70%
Tách axit béo H2SO4 10%
Rửa loại axit vô cơ Nước cất
Tách nước
n-hexan
Làm khan Na2SO4
Cô quay loại dung môi n-hexan
Hỗn hợp axit béo tự do (2,62g) Xà phòng hóa Dầu rong (3,18g) Gia nhiệt 750C
33
Bước 3: Làm giàu AA bằng phương pháp tạo muối với LiOH
Hỗn hợp các axit béo sẽ tạo muối với LiOH trong dung môi axeton, các muối của axit béo no sẽ kết tủa và được lọc để loại ra. Các muối của axit béo không no sẽ tan, độ tan của muối này tăng dần theo số nối đôi của gốc axit béo vì vậy các axit béo càng nhiều nối đôi như AA sau khi phản ứng sẽ giữ lại trong dịch axeton. Chúng tôi đã khảo sát và chọn các điều kiện tối ưu cho phản ứng làm giàu AA bằng phương pháp tạo muối với LiOH là: Thời gian phản ứng tạo muối là 60 phút; Tỉ lệ LiOH/axit béo là 2:1; Nhiệt độ phản ứng từ 35oC ÷ 40oC [19].
Thực nghiệm:
Hòa tan hỗn hợp axit béo tự do trong acetone (V = 10ml), giữ ổn nhiệt 40oC, bổ sung 5ml dung dịch LiOH bão hòa (4N) cho tới khi pH = 9 thì thêm 30ml dung dịch acetone, để nguội từ từ. Hỗn hợp được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và giữ trong 1 giờ. Lọc dịch acetone bằng giấy lọc, phần dịch thu được pha loãng với 250ml nước, axit hóa với HCl đến pH = 3, chiết với ete dầu hỏa 4 lần x 50ml. Loại nước bằng Na2SO4, sau đó đem quay cất đuổi dung môi thu được 1,14g các axit béo không no (UFA).
2.3.6. Phương pháp tách agar
Quy trình này được chúng tôi nghiên cứu xây dựng dựa trên quy trình nấu agar truyền thống vẫn được sử dụng phổ biến hiện nay tại các cơ sở chế biến agar trong nước, cụ thể là Công ty TNHH sản xuất và thương mại Hải Thành – Hải Phòng.
34
Sơ đồ 2.2: Quy trình công nghệ nấu agar từ bã rong đã chiết lipit tổng
Xử lý kiềm Trung hòa về pH= 7 Tẩy trắng Nấu – lọc nóng Rong đã chiết lipit (1000g) Làm lạnh, tan đông
Sấy khô, nghiền
Agar thành phẩm (158g) NaOH 5%,10%,15% H2SO4 1% Giaven 2-5 %, 15 phút Axit oxalic, 30 phút t=3,5,7 ngày Tº= 90ºC, t= 2 giờ
35
Rong câu chỉ vàng, chúng tôi nhận thấy sau khi chiết lipit có màu vàng sáng, do dung môi đã hòa tan một phần chlorophyl và một số tạp chất bám trên bề mặt rong.
Vì vậy, trong quá trình nghiên cứu để xử lý rong đã được chiết lipit tổng, dùng cho quá trình sản xuất agar tiếp theo, chúng tôi tập trung nghiên cứu các yếu tố nồng độ kiềm và thời gian ngâm ảnh hưởng đến chất lượng agar.
Tiến hành các thí nghiệm với nồng độ kiềm khác nhau, bã rong đã chiết lipit, thực hiện trong các điều kiện thời gian khác nhau:
Lượng mẫu: 1kg
Thời gian ngâm: 3, 5 và 7 ngày.
Khảo sát với các nồng độ kiềm: 5%, 10%, 15%.
2.3.7. Phương pháp kiểm tra chất lượng agar
Các chỉ tiêu chất lượng agar được xác định theo quy chuẩn Việt Nam số QCVN 4 – 21: 2011/ BYT [18].
Phương pháp xác định nồng độ gel Thực nghiệm:
Pha các dung dịch mẫu thử agar với hàm lượng 0,2%, 0,25%...cho vào các ống nghiệm có đường kính 16 mm, chiều dài 150 mm. Nút ống nghiệm và làm mát ở nhiệt độ 20-25C trong 1 giờ. Đổ cột gel từ các ống nghiệm lên trên một mặt phẳng. Nồng độ thấp nhất chịu được áp lực trong 5- 30 giây mà không bị gãy vỡ là nồng độ gel của agar cần xác định.
Phương pháp xác định nhiệt độ đông Thực nghiệm:
Cho 10ml dịch agar (1%) hòa tan hoàn toàn bằng nước ở nhiệt độ 100C và một viên bi thủy tinh đường kính 5mm vào ống nghiệm đường kính 2,3cm, cao 6cm. Ống nghiệm này được quay lên và xuống ở nhiệt độ phòng cho đến khi viên bi
36
ngừng chuyển động. Đo nhiệt độ tại thời điểm đó. Nhiệt độ đo được là nhiệt độ đông của agar.
Phương pháp xác định nhiệt độ tan đông của agar Thực nghiệm:
Cho 10 ml dịch agar (1%) hòa tan hoàn toàn bằng nước ở nhiệt độ 100C ống nghiệm đường kính 2,3cm, cao 6cm. Sau đó, nút ống nghiệm và làm mát ở nhiệt độ 20-25 C trong một giờ. Đặt lên bề mặt gel một viên bi thủy tinh. Cho ống nghiệm vào bể ổn nhiệt và tăng dần nhiệt độ từ 20–100C. Quan sát và đo nhiệt độ tại thời điểm viên bi chìm xuống đáy ống nghiệm. Nhiệt độ đo được tại thời điểm đó là nhiệt độ tan đông của agar.
Phương pháp kiểm tra dư lượng dung môi trong agar thành phẩm Thực nghiệm:
Cân 1 – 2 gam rong sau khi chiết lipit tổng, đun ở 100°C, thu hơi, phân tích hơi sinh ra trên máy sác kí khí GC.
37
Chương III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định hàm lượng lipit tổng và thành phần axit béo đặc biệt là axit arachidonic từ nguyên liệu rong câu chi Gracilaria thu tại vùng biển axit arachidonic từ nguyên liệu rong câu chi Gracilaria thu tại vùng biển phía Bắc Việt Nam
3.1.1. Hàm lượng lipit tổngcó trong mẫu rong câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata
Mẫu rong câu Gracilaria tenuistipitata (mẫu T28) được xác định hàm lượng lipit tổng theo phương pháp Blight & Dyer. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hàm lượng lipit tổng của loài rong câu Gracilaria tenuistipitata (mẫu T28)
Loài rong Ký hiệu mẫu Lipit tổng (% khối lượng tươi) Lipit tổng (% khối lượng khô) Gracilaria tenuistipitata T28 0,383 2,03
Qua kết quả đánh giá về làm lượng lipd tổng của loài G. tenuistipitata
cho thấy rong câu chỉ vàng G.tenuistipitata có hàm lượng lipit tổng thấp (0,383% khối lượng rong tươi và 2,03% khối lượng rong khô) tuy nhiên giá trị lipit tổng của nó được thể hiện qua các chỉ số axit béo đặc biệt là các axit béo