CHƯƠNG 2 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT–IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC. Các loại phổ được đo tại Viện Hoá học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.2.4. Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc kí
a. Chọn chất hấp phụ
Thông thường ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngồi ra cịn dùng Sephadex, sắc kí trao đổi ion.
b. Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung mơi hay hệ dung mơi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bước cơ bản sau:
- Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung mơi thích hợp.
- Chuẩn bị 4 – 6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau.
- Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung mơi có độ phân cực khác nhau. Tiếp theo hiện hình dưới đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung mơi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm được hệ dung mơi (trong đó có một dung mơi kém phân cực và một dung mơi phân cực, ví dụ n–hexan : EtOAc) phù hợp để chạy cột sắc kí.
- Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của một phản ứng tổng hợp (2 – 3 chất) thì hệ dung mơi phù hợp là hệ có thể đẩy chất cần quan tâm lên trên bản mỏng với Rf = 0,2 – 0,3.
Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí với hệ dung mơi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
Chú ý:
- Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột hồn tồn giống nhau.
- Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn được ở trên nhưng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ như silicsgel tráng trên bản mỏng có kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
Đối với sắc kí cột Sephadex ta thường dùng một dung môi là MeOH [2].
2.2.5. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột
a. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với lượng silicagel sử dụng
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 – 50 lần khối lượng của mẫu chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 – 200 lần).
b. Tỉ lệ giữa chiều cao lượng silicagel và đường kính trong của cột sắc
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì chiều cao của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng 10 : 1.
Muốn biết lượng silicagel có phù hợp với cột hay khơng thì cho silicagel dạng khơ (chưa có dung mơi) vào cột để quan sát [2].
2.2.6. Cách nạp silicagel vào cột
Để việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường. Silicagel được nạp vào cột theo hai cách.
a. Nạp silicagel ở dạng sệt
Cố định cột trên giá. Nếu đầu ra của cột khơng có lớp thuỷ tinh xốp thì ta cho một lớp bơng mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng. Cho hệ dung mơi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa). Cân lượng silicagel cần thiết (đã tính tốn xác định được ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ và khuấy đều.
Lưu ý: không nên thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung mơi vào
silicagel bởi vì silicagel khi gặp dung mơi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, khơng đồng nhất.
Lượng dung môi phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng khơng được q lỏng.
Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khố để dung mơi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được dùng để rót trở lại đầu cột).
Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lượng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột được đồng nhất.
Lưu ý: nhất thiết không để đầu cột bị khơ, nghĩa là ln ln có dung
mơi phủ trên phần đầu cột.
Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng. Nếu mặt thống chưa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung mơi sát mặt thống làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thống bằng phẳng.
Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm sephadex với dung môi một thời gian để sephadex có thể trương nở ổn định trước khi cho vào cột.
b. Nạp silicagel ở dạng khô
Cột được giữ thẳng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột (nếu cột khơng có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung mơi chạy côt ban đầu vào khoảng hai phần ba cột.
Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khố và cho dung mơi chảy xuống bình hứng (dung mơi này tiếp tục được rót trở lại đầu cột). Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn định trước khi nạp mẫu vào.
Thông thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt [2].
2.2.7. Cách nạp mẫu vào cột
Có hai phương pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phương pháp khơ và phương pháp ướt.
a. Phương pháp khô
Mẫu được nạp ở dạng khô. Thường áp dụng cho trường hợp mẫu chất không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị mẫu: hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung mơi thích hợp, cho một lượng silicagel vừa đủ (lượng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhưng phải đủ để có thể cô quay mẫu được khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay đuổi dung môi đến khơ hồn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp silicagel được điều chỉnh lượng dung môi vừa đủ (đủ thấm ướt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã được gắn đều mẫu thấm đều dung mơi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục.
b. Phương pháp ướt
Thường áp dụng khi mẫu tan hồn tồn trong dung mơi chạy cột ban đầu. Lượng dung mơi dùng hồ tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột. Có thể áp dụng tính tốn cụ thể như sau: thể tích dung mơi cần lấy để hồ tan mẫu = 0,4.d2 ml, với d là đường kính
trong của cột tính bằng mm. Mẫu được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột. Với phương pháp nạp mẫu này chúng ta cho dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khố cột. Sau đó, mở khoá để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lượng nhỏ dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống được đồng đều) [2].
2.3. CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.3.1. Sơ đồ tạo ra các cao chiết 2.3.1. Sơ đồ tạo ra các cao chiết
Quá trình tạo ra cao chiết được mơ tả theo hình 2.1
:
Hình 2.1. Sơ đồ tạo ra các cao chiết
Nguyên liệu
Lá cây Cúc quỳ sấy khô, xay nhỏ (1,2 kg) Chiết với 80% rượu trong nước
(3 lần) ở 40oC
Dịch chiết rượu/ nước Bã
Cô quay loại bớt nước, phân lớp với n-hexan
Phân lớp với CH2Cl2
Phân lớp với BuOH Dịch n – hexan
Cao n–hexan 36,209 gam
Dịch chiết rượu/ nước Cô quay chân không
Dịch CH2Cl2
Cao CH2Cl2 36,795 gam
Cô quay chân không
Cao BuOH 15,539 gam
Cô quay chân không
Dịch BuOH
Dịch chiết rượu/ nước
Dịch chiết rượu/ nước
- Điều chế cao rượu/ nước
Nguyên liệu là lá cây cúc quỳ sau khi thu hái được rửa sạch, phơi, sấy khô rồi đem xay nhỏ thu được 1,2 kg bột. Nguyên liệu được chiết với 80% rượu trong nước
+ Chiết lần một: 1,2 kg bột cúc quỳ được nạp vào bình cầu 20 lít có khuấy, sinh hàn hồi lưu. Cho 5 lít dung dịch ( 80% rượu trong H2O), đun nóng và khuấy trong 4 giờ ở 40oC. Sau đó lọc dịch, thu được thu được 3,0 lít dịch chiết. Cất loại dung mơi đến gần kiệt thu được cao.
+ Chiết lần hai: Cho 4 lít dung dịch ( 80% rượu trong H2O) vào bã cúc quỳ đã chiết lần một, đun và khuấy trong 2 giờ ở 40oC. Sau đó lọc dịch chiết, thu được 3,5 lít dịch chiết. Cất loại dung mơi đến gần kiệt thu được cao.
+ Chiết lần ba: Cho 2,5 lít dung dịch (80% rượu trong H2O) vào bã cúc quỳ đã chiết lần hai, đun và khuấy trong 2 giờ ở 40oC. Sau đó lọc dịch, thu được 2,5 lít dịch chiết. Cất loại dung môi đến gần kiệt thu được cao.
- Điều chế cao n-hexan , cao CH2Cl2 và cao BuOH
Dồn cặn rượu/ nước sau 3 lần chiết vào và cất loại bớt dung mơi cịn 600 ml dịch, phân lớp lần lượt với n-hexan, CH2Cl2 và BuOH.
+ Phân lớp với n-hexan, chiết 3 lần, mỗi lần 500 ml. Tổng dịch chiết 1500 ml, cất loại dung môi thu được 36,209 gam cao n-hexan.
+ Phân lớp với CH2Cl2, chiết 3 lần, lần một 1lít, lần hai 500 ml, lần ba 500 ml. Tổng dịch chiết 2000 ml, cất loại dung môi thu được 36,795 gam cao CH2Cl2.
+ Phân lớp với BuOH chiết 2 lần, mỗi lần 500 ml. Tổng dịch chiết là 1000 ml, cất loại dung môi thu được 15,539 gam cao BuOH.
2.3.2. Chạy cột sắc ký phần cao CH2Cl2
Lấy 36,795 phần cao CH2Cl2 hoà tan hồn tồn vào dung mơi CH2Cl2 trong bình cầu, sau khi chấm bản mỏng để tìm hệ dung mơi thích hợp để chạy
cột ta thêm silicagel (khoảng 50 gam) vào quay cất dưới áp suất thấp đến khô hoàn toàn để chất gắn đều lên silicagel. Làm tơi mịn phần silicagel đã gắn mẫu bằng cối và chày sứ để nạp vào cột sắc kí.
- Chuẩn bị cột sắc kí
Cho hệ dung môi n–hexan : EtOAc = 90 : 10 vào ca nhựa (lựa chọn dựa vào sắc kí lớp mỏng).
Lượng silica gel (Merck, 0,04 – 0,063 mm) lấy khoảng 720 gam cho vào ca nhựa trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
Cho mẫu bơng nhỏ vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Silicagel được cho vào cột ở dạng sệt. - Nạp mẫu vào cột
Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp khô: mẫu khô đã được làm tơi mịn được cho vào cột sắc kí từ từ thơng qua phễu sau khi đã khoá cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phương pháp khơ thì lượng dung mơi phải vừa đủ, không nhiều quá; lượng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ướt đều dung mơi, khơng có bọt khí.
Chạy cột silicagel với hệ dung môi n–hexan – EtOAc tăng dần độ phân cực (hệ dung môi n–hexan : EtOAc = 90 :10; 85:15; 80:20; 75:25; 70:30; 60:40; 50: 50; 40:60; 30:70; 20:80 và cuối cùng là hệ MeOH 100 % ) thu được 20 phân đoạn kí hiệu từ CQD1 đến CQDRG với tổng lượng chất 27,38 gam.
Trong đó, một số phân đoạn có vệt rõ , xuất hiện chất khi chạy thử trên sắc kí bản mỏng, đó là các phân đoạn: CQD12 ( 284 mg); CQD 16 ( 2117
mg); CQD18 ( 6143 mg ) và CQDRG (1627 mg).
Tiến hành chấm bản mỏng 20 phân đoạn trên. Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQD18 có vệt chất trịn và rõ (kiểm tra bản mỏng với hệ
dung môi n-hexan : EtOAc = 7 :1 và 1:1 cho Rf = 0,35), phun thuốc thử vanilin/H2SO4 sau đó sấy khơ cho vết màu. Cô đuổi dung môi thu được 6143 mg chất sạch, ký hiệu CQD18. Đem đo phổ 1H – NMR (CDCl3, 500 MHz), phổ 13C –NMR (CDCl3, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, CDCl3) để xác định cấu trúc.
Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQD16 (2,117 g) có nhiều vệt chất trịn, kí hiệu là CQDA có Rf tương đối khác nhau nên được chọn chạy sắc ký tiếp tục.
2.3.3. Chạy cột sắc ký phân đoạn CQDA
Hòa tan CQDA (2,117 g) trong dung mơi MeOH rồi tiến hành chạy sắc kí cột silicagel (khoảng 63,51 gam) với hệ dung môi CH2Cl2 – EtOAc tăng dần độ phân cực ( hệ dung môi ban đầu CH2Cl2: EtOAc = 100 :1; 98 :2; 95 : 5; 90 : 10; 80 : 20; 70:30; 40:60; 50:50 và cuối cùng là hệ MeOH 100 % ) thu được 11 phân đoạn kí hiệu từ CQDA1 đến CQDA10, và cuối cùng là
CQDARG với tổng lượng chất 1,486 gam.
Tiến hành chấm bản mỏng 11 phân đoạn trên. Một số phân đoạn khi tiến hành chấm thử trên bản mỏng cho vệt rõ , có chất đó là CQDA3 (866
mg); CQDA8 (76 mg); CQDA9 (50 mg). .
Hai phân đoạn CQDA8 và CQDA9 được dồn vào nhau có khối lượng 136 mg tiếp tuc chạy cột sắc ký với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH = 9:1 thu được chất sạch xuất hiện vệt tròn khi chạy trên bản mỏng ( kiểm tra bản mỏng với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH = 8 :2 và 1:1 cho Rf = 0,35), phun thuốc thử vanilin/H2SO4 sau đó sấy khơ cho vết màu. Cơ đuổi dung môi thu được 50 mg chất sạch, ký hiệu CQD8. Đem đo phổ 1H – NMR (MeOH3, 500 MHz), phổ 13C –NMR (MeOH, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, CDCl3) để xác định cấu trúc.
Phân đoạn CQDA3 có vết chất trịn lẫn vào nhau nên được lựa chọn tiếp tục chạy cột sắc ký. Các phân đoạn cịn lại có vệt mờ, lượng chất ít nên chưa khảo sát.
2.3.4. Chạy cột sắc ký phân đoạn CQDA3
Lấy 300 mg trong số 866 mg phân đoạn CQDA3, thêm dung môi
MeOH để hòa tan rồi tiến hành chạy sắc kí pha đảo bằng cột Rp18 với hệ dung môi MeOH : H2O (hệ dung môi ban đầu MeOH : H2O = 1:1; 1,5 : 1, 3 : 1 và cuối cùng là hệ MeOH 100 % ) thu được 3 phân đoạn kí hiệu từ
CQDA3.1 đến CQDA3RG với tổng lượng chất 264 mg.
Tiến hành chấm bản mỏng 3 phân đoạn trên. Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQDA3.1, CQDA3.RG xuất hiện nhiều vệt mờ, lượng chất ít gồm rất nhiều chất khác nhau rất khó tách nên khơng khảo sát. Trong đó, phân đoạn CQDA3.2 (m = 128 mg) có nhiều vệt chất trịn nên được lựa chọn tiếp tục chạy cột sắc ký.
Tiến hành chạy sắc kí cột silicagel với hệ dung mơi n–hexan – EtOAc tăng dần độ phân cực (hệ dung môi ban đầu n–hexan : EtOAc = 90 :10; 80 : 20; 70 : 30; 65 : 35; 60 : 40; 50 : 50; 40:60 ; 30:70; 20:80 và và MeOH:
EtOAC (1:1), cuối cùng là hệ MeOH 100 % ) thu được 7 phân đoạn kí hiệu từ CQDA3.2.1 đến CQDA3.2.RG với tổng lượng chất 128 mg.
Tiến hành chấm bản mỏng 7 phân đoạn trên. Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQD3.2.4 có vệt chất trịn và rõ (kiểm tra bản mỏng với hệ
dung môi n-hexan : EtOAc = 65 : 35 cho Rf = 0,5), phun thuốc thử vanilin/H2SO4 sau đó sấy khơ cho vết màu. Cơ đuổi dung môi thu được 40 mg chất sạch, ký hiệu CQD16. Đem đo phổ 1H – NMR (CDCl3, 500 MHz), phổ 13C –NMR (CDCl3, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, CDCl3) để xác định cấu trúc.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chất CQD 18 , CQD 16 và CQD8 được xác đinh cấu trúc bằng các
phương pháp đo phổ: 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT và so sánh với các tài liệu tham khảo.
3.1. SỐ LIỆU PHỔ VÀ CẤU TRÚC CỦA CHẤT CQD18
Số liệu trên phổ 1H- NMR và phổ 1H- NMR giãn rộng (hình 3.1 và 3.2) của chất CQD18 cho thấy có 26 proton trong phân tử chất CQD18. Số liệu
phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của 19 cacbon. Các đặc trưng vạch phổ và so sánh số liệu phổ với số liệu của chất chuẩn [4] cho phép dự đoán chất CQD18