CHƯƠNG 2 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.2.7. Cách nạp mẫu vào cột
2.3.2. Chạy cột sắc ký phần cao CH2Cl2
Lấy 36,795 phần cao CH2Cl2 hoà tan hồn tồn vào dung mơi CH2Cl2 trong bình cầu, sau khi chấm bản mỏng để tìm hệ dung mơi thích hợp để chạy
cột ta thêm silicagel (khoảng 50 gam) vào quay cất dưới áp suất thấp đến khơ hồn toàn để chất gắn đều lên silicagel. Làm tơi mịn phần silicagel đã gắn mẫu bằng cối và chày sứ để nạp vào cột sắc kí.
- Chuẩn bị cột sắc kí
Cho hệ dung mơi n–hexan : EtOAc = 90 : 10 vào ca nhựa (lựa chọn dựa vào sắc kí lớp mỏng).
Lượng silica gel (Merck, 0,04 – 0,063 mm) lấy khoảng 720 gam cho vào ca nhựa trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
Cho mẫu bơng nhỏ vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Silicagel được cho vào cột ở dạng sệt. - Nạp mẫu vào cột
Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp khô: mẫu khô đã được làm tơi mịn được cho vào cột sắc kí từ từ thơng qua phễu sau khi đã khoá cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phương pháp khơ thì lượng dung mơi phải vừa đủ, không nhiều quá; lượng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ướt đều dung mơi, khơng có bọt khí.
Chạy cột silicagel với hệ dung mơi n–hexan – EtOAc tăng dần độ phân cực (hệ dung môi n–hexan : EtOAc = 90 :10; 85:15; 80:20; 75:25; 70:30; 60:40; 50: 50; 40:60; 30:70; 20:80 và cuối cùng là hệ MeOH 100 % ) thu được 20 phân đoạn kí hiệu từ CQD1 đến CQDRG với tổng lượng chất 27,38 gam.
Trong đó, một số phân đoạn có vệt rõ , xuất hiện chất khi chạy thử trên sắc kí bản mỏng, đó là các phân đoạn: CQD12 ( 284 mg); CQD 16 ( 2117
mg); CQD18 ( 6143 mg ) và CQDRG (1627 mg).
Tiến hành chấm bản mỏng 20 phân đoạn trên. Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQD18 có vệt chất trịn và rõ (kiểm tra bản mỏng với hệ
dung môi n-hexan : EtOAc = 7 :1 và 1:1 cho Rf = 0,35), phun thuốc thử vanilin/H2SO4 sau đó sấy khơ cho vết màu. Cô đuổi dung môi thu được 6143 mg chất sạch, ký hiệu CQD18. Đem đo phổ 1H – NMR (CDCl3, 500 MHz), phổ 13C –NMR (CDCl3, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, CDCl3) để xác định cấu trúc.
Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQD16 (2,117 g) có nhiều vệt chất trịn, kí hiệu là CQDA có Rf tương đối khác nhau nên được chọn chạy sắc ký tiếp tục.