5. Cấu trúc luận văn
2.3. CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.3.1. Sơ đồ tạo ra các cao chiết
Quá trình tạo ra cao chiết được mô tả theo hình 2.1
:
Hình 2.1. Sơ đồ tạo ra các cao chiết
Nguyên liệu
Lá cây Cúc quỳ sấy khô, xay nhỏ (1,2 kg) Chiết với 80% rượu trong nước
(3 lần) ở 40oC
Dịch chiết rượu/ nước Bã
Cô quay loại bớt nước, phân lớp với n-hexan
Phân lớp với CH2Cl2
Phân lớp với BuOH Dịch n – hexan
Cao n–hexan 36,209 gam
Dịch chiết rượu/ nước Cô quay chân không
Dịch CH2Cl2
Cao CH2Cl2
36,795 gam
Cô quay chân không
Cao BuOH 15,539 gam
Cô quay chân không
Dịch BuOH
Dịch chiết rượu/ nước
Dịch chiết rượu/ nước
- Điều chế cao rượu/ nước
Nguyên liệu là lá cây cúc quỳ sau khi thu hái được rửa sạch, phơi, sấy khô rồi đem xay nhỏ thu được 1,2 kg bột. Nguyên liệu được chiết với 80% rượu trong nước
+ Chiết lần một: 1,2 kg bột cúc quỳ được nạp vào bình cầu 20 lít có khuấy, sinh hàn hồi lưu. Cho 5 lít dung dịch ( 80% rượu trong H2O), đun nóng và khuấy trong 4 giờ ở 40oC. Sau đó lọc dịch, thu được thu được 3,0 lít dịch chiết. Cất loại dung môi đến gần kiệt thu được cao.
+ Chiết lần hai: Cho 4 lít dung dịch ( 80% rượu trong H2O) vào bã cúc quỳ đã chiết lần một, đun và khuấy trong 2 giờ ở 40oC. Sau đó lọc dịch chiết, thu được 3,5 lít dịch chiết. Cất loại dung môi đến gần kiệt thu được cao.
+ Chiết lần ba: Cho 2,5 lít dung dịch (80% rượu trong H2O) vào bã cúc quỳ đã chiết lần hai, đun và khuấy trong 2 giờ ở 40oC. Sau đó lọc dịch, thu được 2,5 lít dịch chiết. Cất loại dung môi đến gần kiệt thu được cao.
- Điều chế cao n-hexan , cao CH2Cl2 và cao BuOH
Dồn cặn rượu/ nước sau 3 lần chiết vào và cất loại bớt dung môi còn 600 ml dịch, phân lớp lần lượt với n-hexan, CH2Cl2 và BuOH.
+ Phân lớp với n-hexan, chiết 3 lần, mỗi lần 500 ml. Tổng dịch chiết 1500 ml, cất loại dung môi thu được 36,209 gam cao n-hexan.
+ Phân lớp với CH2Cl2, chiết 3 lần, lần một 1lít, lần hai 500 ml, lần ba 500 ml. Tổng dịch chiết 2000 ml, cất loại dung môi thu được 36,795 gam cao CH2Cl2.
+ Phân lớp với BuOH chiết 2 lần, mỗi lần 500 ml. Tổng dịch chiết là 1000 ml, cất loại dung môi thu được 15,539 gam cao BuOH.
2.3.2. Chạy cột sắc ký phần cao CH2Cl2
Lấy 36,795 phần cao CH2Cl2 hoà tan hoàn toàn vào dung môi CH2Cl2
cột ta thêm silicagel (khoảng 50 gam) vào quay cất dưới áp suất thấp đến khô hoàn toàn để chất gắn đều lên silicagel. Làm tơi mịn phần silicagel đã gắn mẫu bằng cối và chày sứ để nạp vào cột sắc kí.
- Chuẩn bị cột sắc kí
Cho hệ dung môi n–hexan : EtOAc = 90 : 10 vào ca nhựa (lựa chọn dựa vào sắc kí lớp mỏng).
Lượng silica gel (Merck, 0,04 – 0,063 mm) lấy khoảng 720 gam cho vào ca nhựa trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
Cho mẫu bông nhỏ vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Silicagel được cho vào cột ở dạng sệt. - Nạp mẫu vào cột
Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp khô: mẫu khô đã được làm tơi mịn được cho vào cột sắc kí từ từ thông qua phễu sau khi đã khoá cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phương pháp khô thì lượng dung môi phải vừa đủ, không nhiều quá; lượng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ướt đều dung môi, không có bọt khí.
Chạy cột silicagel với hệ dung môi n–hexan – EtOAc tăng dần độ phân cực (hệ dung môi n–hexan : EtOAc = 90 :10; 85:15; 80:20; 75:25; 70:30; 60:40; 50: 50; 40:60; 30:70; 20:80 và cuối cùng là hệ MeOH 100 % ) thu được 20 phân đoạn kí hiệu từ CQD1 đến CQDRG với tổng lượng chất 27,38 gam.
Trong đó, một số phân đoạn có vệt rõ , xuất hiện chất khi chạy thử trên sắc kí bản mỏng, đó là các phân đoạn: CQD12 ( 284 mg); CQD 16 ( 2117 mg); CQD18 ( 6143 mg ) và CQDRG (1627 mg).
Tiến hành chấm bản mỏng 20 phân đoạn trên. Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQD18 có vệt chất tròn và rõ (kiểm tra bản mỏng với hệ
dung môi n-hexan : EtOAc = 7 :1 và 1:1 cho Rf = 0,35), phun thuốc thử vanilin/H2SO4 sau đó sấy khô cho vết màu. Cô đuổi dung môi thu được 6143 mg chất sạch, ký hiệu CQD18. Đem đo phổ 1H – NMR (CDCl3, 500 MHz), phổ 13C –NMR (CDCl3, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, CDCl3) để xác định cấu trúc.
Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQD16 (2,117 g) có nhiều vệt chất tròn, kí hiệu là CQDA có Rf tương đối khác nhau nên được chọn chạy sắc ký tiếp tục.
2.3.3. Chạy cột sắc ký phân đoạn CQDA
Hòa tan CQDA (2,117 g) trong dung môi MeOH rồi tiến hành chạy sắc kí cột silicagel (khoảng 63,51 gam) với hệ dung môi CH2Cl2 – EtOAc tăng dần độ phân cực ( hệ dung môi ban đầu CH2Cl2: EtOAc = 100 :1; 98 :2; 95 : 5; 90 : 10; 80 : 20; 70:30; 40:60; 50:50 và cuối cùng là hệ MeOH 100 % ) thu được 11 phân đoạn kí hiệu từ CQDA1 đến CQDA10, và cuối cùng là
CQDARG với tổng lượng chất 1,486 gam.
Tiến hành chấm bản mỏng 11 phân đoạn trên. Một số phân đoạn khi tiến hành chấm thử trên bản mỏng cho vệt rõ , có chất đó là CQDA3 (866 mg); CQDA8 (76 mg); CQDA9 (50 mg). .
Hai phân đoạn CQDA8 và CQDA9 được dồn vào nhau có khối lượng 136 mg tiếp tuc chạy cột sắc ký với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH = 9:1 thu được chất sạch xuất hiện vệt tròn khi chạy trên bản mỏng ( kiểm tra bản mỏng với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH = 8 :2 và 1:1 cho Rf = 0,35), phun thuốc thử vanilin/H2SO4 sau đó sấy khô cho vết màu. Cô đuổi dung môi thu được 50 mg chất sạch, ký hiệu CQD8. Đem đo phổ 1H – NMR (MeOH3, 500 MHz), phổ 13C –NMR (MeOH, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, CDCl3) để xác định cấu trúc.
Phân đoạn CQDA3 có vết chất tròn lẫn vào nhau nên được lựa chọn tiếp tục chạy cột sắc ký. Các phân đoạn còn lại có vệt mờ, lượng chất ít nên chưa khảo sát.
2.3.4. Chạy cột sắc ký phân đoạn CQDA3
Lấy 300 mg trong số 866 mg phân đoạn CQDA3, thêm dung môi MeOH để hòa tan rồi tiến hành chạy sắc kí pha đảo bằng cột Rp18 với hệ dung môi MeOH : H2O (hệ dung môi ban đầu MeOH : H2O = 1:1; 1,5 : 1, 3 : 1 và cuối cùng là hệ MeOH 100 % ) thu được 3 phân đoạn kí hiệu từ
CQDA3.1 đến CQDA3RG với tổng lượng chất 264 mg.
Tiến hành chấm bản mỏng 3 phân đoạn trên. Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQDA3.1, CQDA3.RG xuất hiện nhiều vệt mờ, lượng chất ít gồm rất nhiều chất khác nhau rất khó tách nên không khảo sát. Trong đó, phân đoạn CQDA3.2 (m = 128 mg) có nhiều vệt chất tròn nên được lựa chọn tiếp tục chạy cột sắc ký.
Tiến hành chạy sắc kí cột silicagel với hệ dung môi n–hexan – EtOAc tăng dần độ phân cực (hệ dung môi ban đầu n–hexan : EtOAc = 90 :10; 80 : 20; 70 : 30; 65 : 35; 60 : 40; 50 : 50; 40:60 ; 30:70; 20:80 và và MeOH: EtOAC (1:1), cuối cùng là hệ MeOH 100 % ) thu được 7 phân đoạn kí hiệu từ CQDA3.2.1 đến CQDA3.2.RG với tổng lượng chất 128 mg.
Tiến hành chấm bản mỏng 7 phân đoạn trên. Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn CQD3.2.4 có vệt chất tròn và rõ (kiểm tra bản mỏng với hệ dung môi n-hexan : EtOAc = 65 : 35 cho Rf = 0,5), phun thuốc thử vanilin/H2SO4 sau đó sấy khô cho vết màu. Cô đuổi dung môi thu được 40 mg chất sạch, ký hiệu CQD16. Đem đo phổ 1H – NMR (CDCl3, 500 MHz), phổ 13C –NMR (CDCl3, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, CDCl3) để xác định cấu trúc.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chất CQD 18 , CQD 16 và CQD8 được xác đinh cấu trúc bằng các phương pháp đo phổ: 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT và so sánh với các tài liệu tham khảo.
3.1. SỐ LIỆU PHỔ VÀ CẤU TRÚC CỦA CHẤT CQD18
Số liệu trên phổ 1H- NMR và phổ 1H- NMR giãn rộng (hình 3.1 và 3.2) của chất CQD18 cho thấy có 26 proton trong phân tử chất CQD18. Số liệu phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của 19 cacbon. Các đặc trưng vạch phổ và so sánh số liệu phổ với số liệu của chất chuẩn [4] cho phép dự đoán chất CQD18
là tagitinin A.
tagitinin A
Cấu trúc của hợp chất CQD18 được khẳng định định thông qua việc phân tích số liệu phổ: 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT như sau:
- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500MHz)
Hai vân phổ ở δ = 6,27; 5,54 ppm có chân rộng tương ứng với 2 proton của nhóm =CH2 đầu mạch. Ứng với vân phổ của 2 proton của nhóm =CH2
chúng ta có thể dự đoán vân phổ ở δ = 4,02 ppm là của proton của nhóm CH liên kết với nhóm C CH2. Các vân phổ có δ = 5,54 -5,59; 4,57; 4,25 ppm có độ dịch chuyển về phía trường thấp gợi ý nhóm CH gắn với oxy. Đặc biệt
2 doublet chồng lên nhau một phần xuất hiện tại δ = 1,05 và 1,07 ppm có J = 6,9 Hz thể hiện tương tác germinal của dimetyl lên nhóm metin [-CH(CH)3]. Vân bội tại δ = 2,44 ppm có J = 6,9Hz là của proton CH bị 6 proton ở 2 nhóm CH3 kề bên tách ra thành 7 vạch, điều này khẳng định có một nhóm iso propyl trong phân tử. Các nhóm CH3, CH, CH2 còn lại nằm trong vùng có độ chuyển dịch hóa học từ 1,11 đến 2,44 ppm.
Các tín hiệu phổ có cường độ mạnh ở δ = 1,11 (3H, d) là của 3H14; ở δ = 1,42 (3H, s) là của 3H15. Hai tín hiệu ở 1,80 và 1,94 ppm (d.d) là của 2H9. Multiplet ở 2,08 ppm là của 2H5; 1H4 và 1H2. Multiplet ở 2,44 ppm là của 1H2 và 1H2’. Doublet – Doublet – Doublet ở 4,02 ppm là của 1H7. Doublet – Doublet ở 4,21 ppm là của 1H1. Doublet – Doublet – Doublet ở 4,55- 4,59 ppm là của 1H6. Hai Doublet 5,54 -5,59 ppm lần lượt là của 1H13 và 1H8. Doublet ở 6,27 ppm là của 1H13. (Phổ 13H-NMRcủa chất CQD18 ở hình 3.1 và hình 3.2)
- Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) và DEPT
Xuất phát từ 13 C-NMR (hình 3.3), DEPT 90 và DEPT 135 (hình 3.4 và 3.5) chúng tôi nhận thấy: phân tử CQD18 có 19 nguyên từ C, trong đó 14 nguyên tử C có liên kết với H, tổng số nguyên tử H liên kết với C là 26.
Trên phổ 13 C-NMR có 19 tín hiệu, tương ứng với 19C, kết hợp với phổ DEPT90 và DEPT135 cho thấy có:
+ 6 nhóm CH (ở δ = 81,59; 69,79; 78,36; 47,71; 44,27; 33,98 ppm). + 4 nhóm CH2 ( ở δ = 121,68; 46,81; 37,67; 34,52 ppm).
+ 4 nhóm CH3 (ở δ = 24,83; 19,07; 18,64; 18,30 ppm).
+ Còn các tín hiệu ở 77,02; 77,27; 76,76 ppm là của dung môi CDCl3. + Với 5 tín hiệu ở δ = 176,42 ; 169,69; 136,98; 105,6; 81,73ppm. C có độ dịch chuyển lớn hơn 160 ppm có thể dự đoán là C của nhóm chức C=O. Do nguyên tử C gắn trực tiếp với nguyên tử O nên độ chuyển dịch hóa học chuyển về phía trường thấp.
Trong đó có 2C ở vùng trường thấp đó là C bậc 4 ( δ =136,98 ppm) và C của nhóm CH2 ( δ = 121,6 8 ppm) là tín hiệu của 2C nhóm olefin (nhóm
C CH2). Ba C của nhóm CH có độ dịch chuyển hóa học lớn nhất (δ =81,59; 69,79; 78,36 ppm) chính là CH gắn với O. Có 2C của 2 nhóm CH3 có độ chuyển dịch gần bằng nhau (δ =18,64; 18,30 ppm) dự đoán là của nhóm (CH3)2CH. (Phổ 13C-NMRvà phổ DEPT của chất CQD18 được trình bày ở các hình 3.3; 3.4 và hình 3.5)
Qua phân tích phổ 13C-NMR, 1H-NMR, DEPT của chất CQD18, kết quả xác định các nhóm nguyên tử trong phân tử được thể hiện trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Độ chuyển dịch hóa học các nhóm nguyên tử của chất CQD18
Vị trí C δC ppm δH ppm Nhóm nguyên tử 1 78,36 4,21-4,62 (1H, dd) CH 2 46,8 2,4-2,47 (1H, m); 2,05-2,12 (1H, m) CH2 3 105,6 C 4 44,27 2,08 (1H, m) CH 5 37,68 2,08 (2H, m) CH2 6 81,59 4,55-4,59 (1H, ddd, J=1,8; 6,6; 10,2 Hz) CH 7 47,71 4,02(1H, ddd, J=3,0; 6,5; 9,8 Hz) CH 8 69,79 5,54-5,59(1H, ddd, J=2,7, 5,4, 6,5 Hz) CH 9 34,52 1,80 (1H, m, J=7,5 và 14,5 Hz, CH-9a) 1,94 (1H, dd, J=14,5 và 5,0 Hz, CH-9b) CH2 10 81,73 - C 11 169,69 - C 12 136,98 - C 13 121,68 6,27(1H, d, J=3,6 Hz, H-13a) 5,54(1H, ddd, J=3,3 Hz, H-13b) CH2 14 19,07 1,11(3H, d, CH3) CH3 15 24,83 1,42(3H, s, CH3) CH3 1’ 176,42 - C 2’ 33,98 2,44 (1H, m) CH 3’ 18,30 1,05(3H, d, J=6,9Hz, CH3) CH3 4’ 18,64 1,07(3H, d, J=6,9Hz, CH3) CH3
Dữ liệu phổ 13C-NMR, 1H-NMR của chất CQD18 và dữ liệu phổ của tagitinin A từ tài liệu [4] được trình bày trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C_NMR của chất CQD18
với chất tagitinin A từ tài liệu
Vị trí C Phổ 1H-NMR (δppm) Phổ 13C-NMR (δppm) δH [4] δH CQD18 δC [4] δC CQD18 1 4,21-4,62 4,25 78,26 78,36 2 2,4-2,47 2,05-2,12 2,44 2,08 47,04 46,8 3 105,73 105,6 4 2,08 2,08 44,34 44,27 5 2,08 2,08 37,79 37,68 6 4,55-4,59 4,57 81,77 81,59 7 4,02 4,08 47,84 47,71 8 5,54-5,59 5,58 70,39 69,79 9 1,94 1,80 1,96 1,80 34,62 34,52 10 - - 81,46 81,73 11 - - 169,42 169,69 12 - - 137,07 136,98 13 6,27 5,54 6,27 5,54 121,57 121,68 14 1,11 1,11 19,18 19,07 15 1,42 1,44 24,99 24,83 1’ - - 176,34 176,42 2’ 2,44 2,44 34,03 33,98 3’ 1,05 1,08 18,34 18,30 4’ 1,07 1,06 18,72 18,64
Từ sự phân tích các dữ kiện trên và so sánh với các sesquiterpen được công bố trên tài liệu [4] cho phép khẳng định cấu trúc của chất CQD18 như sau:
3.2. SỐ LIỆU PHỔ VÀ CẤU TRÚC CỦA CHẤT CQD16
Dựa trên phổ 1H- NMR và phổ 1H- NMR giãn rộng (hình 3.6, 3.7 và hình 3.8) của chất CQD16 cho thấy có 26 proton trong phân tử chất CQD16. Số liệu phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của 18 cacbon. Các đặc trưng vạch phổ và so sánh số liệu phổ với số liệu của chất chuẩn [22] cho phép dự đoán chất CQD16 là tagitinin C. O O O O OH O 1 2 3 5 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1' 2' 3' 4' tagitinin C
Cấu trúc của hợp chất CQD16 được khẳng định định thông qua việc phân tích số liệu phổ: 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT như sau:
- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500MHz)
Số liệu phổ 1H-NMR của chất CQD16 có các tín hiệu tương tự với chất
CQD18 như sau : hai vân phổ ở δ = 6,35 ; 5,81 pm có chân rộng tương ứng với 2 proton của nhóm =CH2 đầu mạch. Ứng với vân phổ của 2 proton của nhóm =CH2 chúng ta có thể dự đoán vân phổ ở δ = 3,54- 3,58 ppm là của proton của nhóm CH liên kết với nhóm C CH2. Các vân phổ có δ = 5,33- 5,38; 5,42 ppm gợi ý cho chúng ta nhóm CH gắn với oxy. Đặc biệt 2 doublet chồng lên nhau một phần xuất hiện tại δ = 1,05 và 1,07 ppm có J = 6,9 Hz thể hiện tương tác germinal của dimetyl lên nhóm metin [-CH(CH)3]. Vân bội tại δ = 2,40- 2,49 ppm có J = 6,9Hz là của proton CH bị 6 proton ở 2 nhóm CH3
kề bên tách ra thành 7 vạch, điều này khẳng định có một nhóm iso propyl trong phân. Các doublet ở δ = 6,94; 6,25 và 5,88 ppm được dự đoán là nhóm CH gắn nối đôi. Các nhóm CH3, CH, CH2 còn lại nằm trong vùng có độ chuyển dịch hóa học từ 1,54 đến 2,42 ppm.
Các tín hiệu phổ có cường độ mạnh ở δ = 1,54 (3H, s) là của 3H15 và δ = 1,95 (3H, s, br) là của 3H14. Hai tín hiệu ở 2,02 và 2,42 ppm (d.d) là của 2H9. Doublet – Doublet ở 3,54 – 3,58 ppm là của 1H7. Multiplet ở 5,3 – 5,38 ppm là của 1H8. Doublet – Doublet ở 5,41; 5,81; 5,87; 6,25; 6,35; 6,94 ppm lần lượt là của 1H6; 1H13; 1H5; 1H2; 1H13; 1H1.
- Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) và DEPT
Bên cạnh đó, dựa trên phổ 13 C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 chúng tôi nhận thấy: phân tử CQD16 có 18 nguyên từ C, trong đó 12 nguyên tử C có liên kết với H, tổng số nguyên tử H liên kết với C là 22.
Trên phổ 13 C-NMR có 18 tín hiệu, tương ứng với 18C, kết hợp với phổ DEPT90 và DEPT135 cho thấy có:
+ 6 nhóm CH (ở δ = 137,15; 129,68 ; 75,97; 73,90; 47,09; 34,06 ppm). + 2 nhóm CH2 ( ở δ = 124,46; 48,44 ppm).
+ 4 nhóm CH3 (ở δ = 29,07; 19,67; 18,8; 18,630 ppm).
+ Còn các tín hiệu ở 76,77; 77,02; 77,28 ppm là của dung môi CDCl3. + Với 6 tín hiệu ở δ = 196,68; 176,19; 169,65; 138,96; 136,08; 72,07 ppm. C có độ dịch chuyển lớn hơn 160 ppm có thể dự đoán là C của nhóm chức C=O. Do đó, chất CQD16 có 3 nhóm C=O.