6. Bốc ục của luận văn
2.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
2.6.1.Đặc điểm của nhóm vi khuẩn Bacillus
Bacillus là những vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này thường tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Thuộc chi Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dường, nhiệt độ cao,...phần lớn tế bào này có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu.
Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng. Một
đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit. Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn B. Subtiỉỉs có khả
năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức
2.6.2.Thử hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch petri
a. Nguyên tắc
Lấy 20-30ml môi trường thạch vô trùng, để nguội đến 50 C rồi đổ vào
đĩa Petri (thao tác vô trùng). Nếu có nước ngưng tụ trên nắp hộp cần úp ngược xuống để vào tủấm 30-37 Cđể làm khô mặt thạch.
Lấy một vòng que cấy gạt 3-4 lần trên mặt thạch để cấy đều vi khuẩn lên mặt thạch, sau đó tiến hành đục 3 “giếng” rồi cho vào đó 3 loại dung dịch đã
được chuẩn bị sẵn là: dịch chiết nghệ (đã được pha loãng đến cùng nồng độ
với dịch nano tạo ra), dung dịch AgNO 1mM, dịch nano Ag được vừa được tạo ra.
Sau đó gói cẩn thận để nơi thoáng mát, vô trùng trong 2 ngày, rồi chụp
ảnh, báo cáo kết quả.
Hình 2.6: Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch
b. Phương pháp cấy truyền các tế bào vi khuẩn [2][9]
Chuyển một loại vi khuẩn nhất định đang sống từ bình nuôi hoặc giống gốc sang môi trường thích hợp để các vi khuẩn này tiếp tục được nhân lên, gọi là cấy hay cấy truyền. Để tránh tạp nhiễm người ta thường tiến hành cấy
truyền trong các tủ cấy có thổi khí vô trùng với các thao tác quy định. Trong bài viết này chúng tôi giới thiệu các phương pháp cấy truyền các tế bào vi khuẩn thông dụng.
a. Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, môi trường và chủng vi khuẩn
- Dụng cụ
Pipet pasteur có nút bông: bao gói kín, khử trùng khô; que cấy đầu tròn (inoculating loop) đường kính 2 – 4mm làm bằng dây platin, may-xo gắn vào cán nhôm hoặc hợp kim không gỉ, chuôi cán có bọc nhựa tránh nóng dài khoảng 16-17cm (hình 1); que tăm bông vô khuẩn; bơm tiêm và kim tiêm chịu nhiệt: khử trùng bằng hơi nước 121 C/20 – 30 phút; đèn cồn; giá cắm
ống nghiệm; giá cắm pipet…
- Hóa chất, môi trường
Nước muối sinh lý vô khuẩn; môi trường lỏng vô khuẩn; môi trường đặc vô khuẩn; dung dịch sát khuẩn cresyl 3 - 5% hay cồn 70
- Vi khuẩn
(Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis…) đã nuôi cấy trên môi trường đặc, hoặc mẫu có vi khuẩn (sữa chua, tôm chua, biosubtyl…).
b. Tiến hành cấy truyền trên môi trường lỏng
- Chuẩn bị đủ phương tiện cần thiết như pipet nếu ống giống là lỏng, hoặc que cấy nếu ống giống là môi trường thạch cứng.
- Đánh dấu ống môi trường cho phù hợp với ống giống (dán nhãn ghi tên vi khuẩn, ngày cấy truyền vào thành ống nghiệm dưới nút bông một chút)
- Cấy truyền bằng pipet pasteur
o Khử trùng pipet pasteur qua ngọn lửa đèn cồn.
o Tay trái cầm ống giống gốc, dùng ngón tay út phải mở nút bông của
o Cho pipet pasteur vào ống giống lỏng để lấy dịch vi khuẩn (dịch dâng lên trong pipet từ từ theo lực mao dẫn), nhanh chóng đặt ngón tay trỏ phải lên
đầu pipet, rút pipet ra khỏi ống, đậy nút bông lại rồi đặt ống giống vào giá. o Cầm ống môi trường mới bằng tay trái, mở nút bằng ngón tay út phải, khử khuẩn miệng ống, cho pipet vào tới khi đầu pipet chạm vào môi trường và để chảy ra vài giọt dịch chứa vi khuẩn. Rút pipet ra, khử trùng miệng ống,
đậy nút.
o Đặt pipet vào bình đựng thuốc sát khuẩn.
- Cấy truyền bằng que cấy
o Cầm que cấy thẳng đứng, đốt đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, đưa ngang phần kim loại trên đèn vài lần ta có que cấy đã vô trùng.
o Lấy một vòng que cấy đầu tròn vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng trong điều kiện vô trùng (các thao tác như tiến hành như cấy truyền bằng pipet pasteur).
o Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuẩn tan trong môi trường.
o Khử trùng que cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn.
o Sau khi cấy truyền xong đặt môi trường vào tủ ấm ở nhiệt độ, thời gian thích hợp tùy từng loài vi khuẩn.
- Nhận xét kết quả
o Vi khuẩn làm đục đều môi trường.
o Vi khuẩn phát triển lắng xuống đáy môi trường. o Vi khuẩn mọc thành váng trên mặt môi trường.
c. Cấy truyền trên môi trường đặc
Cấy truyền trên môi trường thạch đĩa: có thể cấy truyền trên đĩa petri theo một trong các cách sau:
o Tay trái cầm đĩa môi trường, khử trùng nơi định mở trên ngọn lửa đèn cồn, dùng ngón tay cái và ngón giữa tay trái đẩy nắp hộp lồng lên.
o Tay phải cầm que cấy lấy một vòng mẫu, ria cấy trên môi trường theo phương pháp cấy cạn dần (hình 1).
o Đậy nắp môi trường, đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
Hình 2.7: Cách cấy truyền trên môi trường đĩa thạch
(1)Cấy lấy giống, (2) Cách ria cây, (3) Kết quả sau 24 – 48 giờ nuôi cấy
- Cách 2
Hút 0,1ml dịch cấy, nhỏ lên đĩa petri có môi trường dinh dưỡng đặc Dùng que trang gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa
- Cách 3
Hút 0,1ml dịch cấy, nhỏ lên đĩa petri có môi trường dinh dưỡng đặc ở
nhiệt độ50 C
Lay nhẹ đĩa thạch theo chiều đông-bắc,tây-nam cho vi khuẩn phân bố đều trong môi trường thạch còn nóng.
Đặt vào tủấm ở nhiệt độ thích hợp 28−30 C, thời gian 24 – 48giờ.
c. Cấy truyền trên môi trường thạch ống [2][9]
Khi cấy truyền thì tay trái cầm ống nghiệm, phần dưới ống nghiệm nằm trong lòng ngón tay và bàn tay. Mỗi lần cầm nhiều nhất là 3 ống, trong đó 1
kim loại để khử trùng. Dùng tay phải mở nút bông bằng cách kẹp giữa ngón tay rồi hơ và xoay tròn miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng bỏng mới thôi. Dí đầu que cấy đã nguội vào ống giống và gạt nhẹ chỗ có giống mọc tốt đem vạch lên ống thạch mới từ dưới lên theo đường hình chữ
chi hoặc vòng xoắn (hình 2.8: d, g, h)… sao cho đầu que cấy không chạm vào
ống nghiệm còn nóng. Khi 2 ống đã cấy xong thì ta hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn rồi đậy nút bông lại. Các que cấy đã cấy xong cần được đốt cho vô trùng. Muốn cấy vi khuẩn kỵ khí ta dùng que cấy hình kim tiêm sâu vào môi trường. Các bình, dụng cụ chứa môi trường có vi khuẩn mới cấy cần
được đưa ngay vào tủ ấm có bộ phận điều nhiệt và điều chỉnh nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng. Thông thường duy trì nhiệt độ thích hợp là 20−30 C, thời gian 24 – 48giờ.
Hình 2.8: Một số dụng cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn
(a) Que cấy vòng, (b) Que cấy hình kim, (c) Pipet Pasteur, (d, g, h) một số
kiểu cấy, (i) Cấy vi khuẩn kỵ khí bằng qua cây hình kim
Nhận xét kết quả: Nhận xét hình thái khuẩn lạc: màu sắc, kích thước, dạng: S (Smooth) - nhẵn, bóng hay dạng R (Rough) - nhăn nheo, hoặc dạng M (Mucoid) - nhầy nhớt.
d. Những điểm cần lưu ý
Môi trường đặc phải có bề mặt khô, phẳng. Nếu ống môi trường còn
đọng nước cần dựng ống mới cấy vào giá ống nghiệm, tránh nước làm hoen vết cấy.
Khi tiến hành cấy truyền tránh chạm đầu que cấy dùng để lấy vi khuẩn vào bất cứ vật gì.
Nếu dịch vi khuẩn cấy truyền rơi xuống mặt bàn cần lau ngay bằng panh kẹp bông thấm cồn hoặc nước sát trùng.
Nếu bình nuôi quá to cần có người phụ giúp trong việc kéo, dậy nút bông…
Khi cấy truyền vi khuẩn người ta dùng tay trái cầm hai ống nghiệm; ống có vi sinh vật ở xa và ống môi trường ở gần người thao tác. Trước và sau khi cấy truyền xong phải hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng que cấy.²
e. Phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn
Phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn, ta tẩm dung dịch nano bạc vào một đĩa giấy ở nồng độ nhất định, rồi đặt đĩa có tẩm đó lên mặt môi trường thạch có cấy vi khuẩn thử nghiệm trước đó. Dung dịch nano bạc sẽ nhanh chóng khuếch tán trên môi trường thạch ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ [11][18]. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp ta biết được mức độ kháng khuẩn cuối cùng của dung dịch nano bạc (thể hiện qua bán kính vòng vô khuẩn) [11][18].
2.6.3. Ứng dụng kháng khuẩn trên vật liệu gốm xốp
a. Giới thiệu về vật liệu gốm xốp
chứa bằng nhựa hoặc gốm, và một vòi nhựa. Nước được đổ vào phần trên hoặc đổ trực tiếp vào màng lọc, nơi mà lực hấp dẫn kéo nó thông qua các lỗ
trong gốm lọc và đi và phần dưới của bình chứa. Nước sau khi được lọc sẽ được chứa ở một bình bên dưới và được lấy ra sử dụng.
Hình 2.9: Gốm xốp được dùng làm thiết bị lọc nước trong gia dụng
b. Nguyên lý lọc nước
Hình 2.10: Minh họa khả năng diệt vi khuẩn của nano bạc
Nguyên lý của lõi lọc là: người ta tạo ra các lõi lọc có khe lọc rộng từ
100 nanomet, có thể ngăn được vi khuẩn không đi xuyên qua lõi lọc. Khi vi khuẩn đi vào lõi lọc, nó bị mắc kẹt tại các khe lọc. Với vật liệu lọc nước được trộn với Nano bạc (Ag ), khi nằm tại các khe lọc, bạc Nano silver có đủ thời
gian để giết chết vi khuẩn, và hạn chế vi khuẩn phát triển trong lõi lọc, tránh
được nguy cơ vi khuẩn phát triển và phá vỡ tấm lọc.
Ý nghĩa của từ "nano" đối với lõi lọc này không phải là kích thước lọc
đạt cỡ nano, mà là ứng dụng nano bạc (Ag ) trong việc diệt vi khuẩn.
Các phân tử nano bạc thường được kết hợp trong các lõi than hoạt tính, hoặc các lõi lọc có kết hợp với các vật liệu hấp phụ khác. Xét về khả năng diệt vi khuẩn thật sự của kim loại bạc thì bạc không có khả năng diệt khuẩn tức thời khi nước đi qua. Bạc chỉ có khả năng tiêu diệt vi khuẩn nếu thời gian tiếp xúc của vi khuẩn với nano bạc là lớn hơn 6 phút. Nano bạc thực sự hữu ích trong các ứng dụng phủ lên các bề mặt, để diệt khuẩn trên các bề mặt vật dụng.
Bảng 2.1: So sánh ưu nhược điểm của việc sử dụng gốm xốp lọc nước
Ưu điểm Nhược điểm
Loại bỏđược vi khuẩn và các sinh vật gây bệnh nên giảm được bệnh tiêu chảy do dùng nước bẩn lên
tới 70%. Giảm độ đục và cải thiện được mùi Tận dụng được các nguyên liệu sẵn có. Sử dụng dễ dàng và có thể tái sử dụng nhiều lần sau khi đã vệ sinh
Sản xuất rẻ tiền
Không loại được virus, kim loại nặng và thuốc trừ sâu- Tuổi thọ của
bộ lọc chưa xác định được- Tốc độ
lọc chậm
Mất nhiều thời gian rửa lõi lọc Khó giám sát chất lượng
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÍ
3.1.1. Xác định độ ẩm
Thực hiện cân 3 lần đối với cả 3 cốc đựng bột nghệ sau khi đã cho vào tủ
sấy ở t C và làm nguội bằng cách cho vào bình hút ẩm. Ta thu được kết quả, tính toán số liệu cho được độ ẩm trung bình của mẫu nghệ là:
Bảng 3.2: Kết quả thu được về độẩm của mẫu bột nghệ đầ Cân lần 1 Cân lần 2 Cân lần 3 % Độ ẩm TB Mẫu 1 57,509 57,375 57,360 57,360 0,144 12,766 Mẫu 2 48,931 48,753 48,718 48,718 0,201 11,537 Mẫu 3 55,323 55,160 55,137 55,137 0,178 12,333 Độ ẩm trung bình của mẫu nghệ 12,212
Độ ẩm trung bình trong mẫu bột nghệ là 12,212 %. Bột nghệ có thể dễ
dàng bảo quản trong thời gian dài, để đảm bảo bột nghệ không bị hư hỏng ta có thể cho bột nghệ vào bình có chứa gói hút ẩm.
3.1.2. Xác định hàm lượng tro
Tiến hành cân chén sứ có chứa tro nghệ sau khi đã tro hóa hoàn toàn mẫu nghệ, ta thu được kết quả và tính toán ta được hàm lượng tro trong mẫu nghệ cho ở bảng 3.3:
Xác định hàm lượng tro ở 500 C, thời gian khoảng 3h30 phút thu được kết quả. Hàm lượng tro trung bình trong mẫu bột nghệ là khá cao, chiếm 9,115 % khối lượng củ.
Bảng 3.3: Kết quả thu được về hàm lượng tro của mẫu bột nghệ đầ Chén sứ Sau khi nung % Hàm lượng tro TB Mẫu 1 32,196 31,188 31,275 0,087 8,631 Mẫu 2 36,017 34,467 34,618 0,151 9,742 Mẫu 3 30,006 28,702 28,819 0,117 8,972
Hàm lượng tro trung bình của mẫu nghệ 9,115
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT NƯỚC CỦ NGHỆ
3.2.1.Khảo sát theo tỉ lệ rắn/lỏng
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với các thông số như sau:
- Thời gian chiết: 1h30 phút
- Thời gian tạo nano bạc: 60 phút.
- Nhiệt độ tạo nano bạc: nhiệt độ phòng.
- Nồng độ dung dịch AgNO ; 1 mM.
- Tỉ lệ ể í ị ế
ị =
- Môi trường pH = 7
- Tỉ lệ rắn lỏng: tôi cố định thể tích nước = 20 , còn khối lượng mẫu củ nghệ: m = 0,2 gam; 0,4 gam; 0,6 gam; 0,8 gam; 1,0 gam.
Nhận xét: Từ hình 3.2 cho thấy khi tỉ lệ rắn/lỏng là khoảng 0,4g/20 ml thì mật độ quang đo được là cao nhất (Amax ≈ 0,16), nghĩa là lượng nano bạc tạo thành là tốt nhất và nếu tiếp tục tăng khối lượng mẫu củ nghệ thì giá trị
mật độ quang giảm. Có thể giải thích như sau: khi khối lượng mẫu củ nghệ
nhanh, dễ keo tụ lại, hạt tạo thành có kích thước lớn gây giảm mật độ quang. Vì vậy, tỉ lệ rắn lỏng thích hợp là khoảng 0,4g/20ml.
Hình 3.1: Hình ảnh 5 mẫu dịch chiết khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng
đến quá trình tạo nano bạc
Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khả năng tạo nano bạc vào tỉ lệ rắn lỏng được biểu diễn ở hình 3.2.
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng đến quá trình tạo nano bạc
3.2.2. Khảo sát theo thời gian chiết
Để khảo sát sự phụ thuộc của khả năng tạo dịch chiết củ nghệ tối ưu (tức dịch chiết có khả năng tạo nano bạc tốt nhất) vào thời gian chiết, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với các thông số như sau:
- Tỉ lệ rắn/lỏng: 0,40 g củ nghệ /20 ml nước cất.