CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.3. Khảo sát pH môi trường tạo nano bạc
Chọn pH môi trường, biến thiên: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 để khảo sát.
Lấy Vml dịch chiết, thêm vào Vml dung dịch AgNO 1mM. Lắc trong thời gian t phút, đợi cho màu nano Ag xuất hiện rồi đem đo UV-Vis.
2.4.4. Khảo sát nhiệt độ tạo nano bạc
Chọn nhiệt độđể khảo sát là
T = 30 C; 40 C; 50 C; 60 C; 70 C; 80 C
Lấy Vml dịch chiết, thêm vào Vml dung dịch AgNO 1mM. Lắc trong thời gian t phút, đợi cho màu nano Ag xuất hiện rồi đem đo UV-Vis.
2.4.5.Khảo sát thời gian tạo nano bạc
2.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.5.1.Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hoạt động trên nguyên tắc giống thấu kính quang học, chỉ khác là sử dụng sóng điện tử thay cho bước sóng ánh sáng nên có bước sóng rất ngắn) và sử dụng các thấu kính điện từ - magnetic lens thay cho thấu kính quang học[12].
Ảnh của kính hiển vi điện tử truyền qua cho phép ta quan sát được hình dạng và xác định được kích thước của các hạt nano.
Hình 2.2: Ảnh TEM của các hạt nano bạc kích thước 10 nm[11]
2.5.2.Phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)
Hình 2.3: Ảnh UV-Vis của các hạt nano bạc[17]
UV-Vis (Ultraviolet–visible spectroscopy) là phương pháp phân tích sử
dụng phổ hấp thụ hoặc phản xạ trong phạm vi vùng cực tím cho tới vùng ánh sáng nhìn thấy được.
Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-Vis để
xác định các thuộc tính trên.
Do hạt nao bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt plasmon duy nhất nên trong phổ UV-Vis của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta xử dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc[19].
2.5.3. Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX)
Phổ tán xạ năng lượng tia X, hay Phổ tán sắc năng lượng là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tương tác với các bức xạ (mà chủ yếu là chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử). Trong các tài liệu khoa học, kỹ
thuật này thường được viết tắt là EDX hay EDS xuất phát từ tên gọi tiếng Anh Energy-dispersive X-ray spectroscopy.
Nguyên tắc hoạt động
Kỹ thuật EDX chủ yếu được thực hiện trong các kính hiển vi điện tử, ở đó ảnh vi cấu trúc vật rắn được ghi lại thông qua việc sử dụng chùm điện tử
có năng lượng cao tương tác với vật rắn. Khi chùm điện tử có năng lượng lớn
được chiếu vào vật rắn, nó sẽ đâm xuyên sâu vào nguyên tử vật rắn và tương tác với các lớp điện tử bên trong của nguyên tử.
Hình 2.4: Ảnh mô hình tán xạ tia X.
Tương tác này dẫn đến việc tạo ra các tia X có bước sóng đặc trưng tỉ lệ
f = v = m q 8h €
3
4 (Z−1) = (2.48.10 Hz)(Z−1)
Có nghĩa là, tần số tia X phát ra là đặc trưng với nguyên tử của mỗi chất có mặt trong chất rắn. Việc ghi nhận phổ tia X phát ra từ vật rắn sẽ cho thông tin về các nguyên tố hóa học có mặt trong mẫu đồng thời cho các thông tin về
tỉ phần các nguyên tố này (xem chi tiết về cơ chế tạo tia X).
Có nhiều thiết bị phân tích EDX nhưng chủ yếu EDX được phát triển trong các kính hiển vi điện tử, ởđó các phép phân tích được thực hiện nhờ các chùm điện tử có năng lượng cao và được thu hẹp nhờ hệ các thấu kính điện từ. Phổ tia X phát ra sẽ có tần số (năng lượng photon tia X) trải trong một vùng rộng và được phân tích nhờ phổ kế tán sắc năng lượng do đó ghi nhận thông tin về các nguyên tố cũng như thành phần. Kỹ thuật EDX được phát triển từ những năm 1960s và thiết bị thương phẩm xuất hiện vào đầu những năm 1970s với việc sử dụng detector dịch chuyển Si, Li hoặc Ge.
2.5.4. Phổ nhiễu xạ tia X (XRD)
Hình 2.5: Ảnh mô hình nhiễu xạ tia X.
Nhiễu xạ tia X là hiện tượng các chùm tia X nhiễu xạ trên các mặt tinh thể của chất rắn do tính tuần hoàn của cấu trúc tinh thể tạo nên các cực đại và
cực tiểu nhiễu xạ. Kỹ thuật nhiễu xạ tia X (thường viết gọn là nhiễu xạ tia X)
được sử dụng để phân tích cấu trúc chất rắn, vật liệu... Xét về bản chất vật lý, nhiễu xạ tia X cũng gần giống với nhiễu xạ điện tử, sự khác nhau trong tính chất phổ nhiễu xạ là do sự khác nhau về tương tác giữa tia X với nguyên tử và sự tương tác giữa điện tử và nguyên tử.
Nguyên lý của nhiễu xạ tia X
Xét một chùm tia X có bước sóng chiếu tới một tinh thể chất rắn dưới góc tới. Do tinh thể có tính chất tuần hoàn, các mặt tinh thể sẽ cách nhau những khoảng đều đặn, đóng vai trò giống như các cách tử nhiễu xạ và tạo ra hiện tượng nhiễu xạ của các tia X.
Nếu ta quan sát các chùm tia tán xạ theo phương phản xạ (bằng góc tới) thì hiệu quang trình giữa các tia tán xạ trên các mặt là:
ΔL = 2. d. sinθ
Như vậy, để có cực đại nhiễu xạ thì góc tới phải thỏa mãn điều kiện:
ΔL = 2. d. sinθ= n.λ
Ởđây, là số nguyên nhận các giá trị 1, 2,...
Đây là định luật Vulf-Bragg mô tả hiện tượng nhiễu xạ tia X trên các mặt tinh thể.
- Cường độ nhiễu xạ:
Cường độ chùm tia nhiễu xạ được cho bởi công thức: I = ψ α F
Với ψ là hàm sóng của chùm nhiễu xạ, còn F là thừa số cấu trúc (hay còn gọi là xác suất phản xạ tia X), được cho bởi:
Ở đây, “g” là véctơ tán xạ của chùm nhiễu xạ, r là vị trí của nguyên tử
thứ “i” trong ô đơn vị, còn “f ” là khả năng tán xạ của nguyên tử. Tổng được lấy trên toàn ô đơn vị.
- Phổ nhiễu xạ tia X:
Phổ nhiễu xạ tia X là sự phụ thuộc của cường độ nhiễu xạ vào góc nhiễu xạ (thường dùng là 2 lần góc nhiễu xạ).
2.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN 2.6.1.Đặc điểm của nhóm vi khuẩn Bacillus 2.6.1.Đặc điểm của nhóm vi khuẩn Bacillus
Bacillus là những vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này thường tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Thuộc chi Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dường, nhiệt độ cao,...phần lớn tế bào này có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu.
Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng. Một
đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit. Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn B. Subtiỉỉs có khả
năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức
2.6.2.Thử hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch petri
a. Nguyên tắc
Lấy 20-30ml môi trường thạch vô trùng, để nguội đến 50 C rồi đổ vào
đĩa Petri (thao tác vô trùng). Nếu có nước ngưng tụ trên nắp hộp cần úp ngược xuống để vào tủấm 30-37 Cđể làm khô mặt thạch.
Lấy một vòng que cấy gạt 3-4 lần trên mặt thạch để cấy đều vi khuẩn lên mặt thạch, sau đó tiến hành đục 3 “giếng” rồi cho vào đó 3 loại dung dịch đã
được chuẩn bị sẵn là: dịch chiết nghệ (đã được pha loãng đến cùng nồng độ
với dịch nano tạo ra), dung dịch AgNO 1mM, dịch nano Ag được vừa được tạo ra.
Sau đó gói cẩn thận để nơi thoáng mát, vô trùng trong 2 ngày, rồi chụp
ảnh, báo cáo kết quả.
Hình 2.6: Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch
b. Phương pháp cấy truyền các tế bào vi khuẩn [2][9]
Chuyển một loại vi khuẩn nhất định đang sống từ bình nuôi hoặc giống gốc sang môi trường thích hợp để các vi khuẩn này tiếp tục được nhân lên, gọi là cấy hay cấy truyền. Để tránh tạp nhiễm người ta thường tiến hành cấy
truyền trong các tủ cấy có thổi khí vô trùng với các thao tác quy định. Trong bài viết này chúng tôi giới thiệu các phương pháp cấy truyền các tế bào vi khuẩn thông dụng.
a. Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, môi trường và chủng vi khuẩn
- Dụng cụ
Pipet pasteur có nút bông: bao gói kín, khử trùng khô; que cấy đầu tròn (inoculating loop) đường kính 2 – 4mm làm bằng dây platin, may-xo gắn vào cán nhôm hoặc hợp kim không gỉ, chuôi cán có bọc nhựa tránh nóng dài khoảng 16-17cm (hình 1); que tăm bông vô khuẩn; bơm tiêm và kim tiêm chịu nhiệt: khử trùng bằng hơi nước 121 C/20 – 30 phút; đèn cồn; giá cắm
ống nghiệm; giá cắm pipet…
- Hóa chất, môi trường
Nước muối sinh lý vô khuẩn; môi trường lỏng vô khuẩn; môi trường đặc vô khuẩn; dung dịch sát khuẩn cresyl 3 - 5% hay cồn 70
- Vi khuẩn
(Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis…) đã nuôi cấy trên môi trường đặc, hoặc mẫu có vi khuẩn (sữa chua, tôm chua, biosubtyl…).
b. Tiến hành cấy truyền trên môi trường lỏng
- Chuẩn bị đủ phương tiện cần thiết như pipet nếu ống giống là lỏng, hoặc que cấy nếu ống giống là môi trường thạch cứng.
- Đánh dấu ống môi trường cho phù hợp với ống giống (dán nhãn ghi tên vi khuẩn, ngày cấy truyền vào thành ống nghiệm dưới nút bông một chút)
- Cấy truyền bằng pipet pasteur
o Khử trùng pipet pasteur qua ngọn lửa đèn cồn.
o Tay trái cầm ống giống gốc, dùng ngón tay út phải mở nút bông của
o Cho pipet pasteur vào ống giống lỏng để lấy dịch vi khuẩn (dịch dâng lên trong pipet từ từ theo lực mao dẫn), nhanh chóng đặt ngón tay trỏ phải lên
đầu pipet, rút pipet ra khỏi ống, đậy nút bông lại rồi đặt ống giống vào giá. o Cầm ống môi trường mới bằng tay trái, mở nút bằng ngón tay út phải, khử khuẩn miệng ống, cho pipet vào tới khi đầu pipet chạm vào môi trường và để chảy ra vài giọt dịch chứa vi khuẩn. Rút pipet ra, khử trùng miệng ống,
đậy nút.
o Đặt pipet vào bình đựng thuốc sát khuẩn.
- Cấy truyền bằng que cấy
o Cầm que cấy thẳng đứng, đốt đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, đưa ngang phần kim loại trên đèn vài lần ta có que cấy đã vô trùng.
o Lấy một vòng que cấy đầu tròn vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng trong điều kiện vô trùng (các thao tác như tiến hành như cấy truyền bằng pipet pasteur).
o Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuẩn tan trong môi trường.
o Khử trùng que cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn.
o Sau khi cấy truyền xong đặt môi trường vào tủ ấm ở nhiệt độ, thời gian thích hợp tùy từng loài vi khuẩn.
- Nhận xét kết quả
o Vi khuẩn làm đục đều môi trường.
o Vi khuẩn phát triển lắng xuống đáy môi trường. o Vi khuẩn mọc thành váng trên mặt môi trường.
c. Cấy truyền trên môi trường đặc
Cấy truyền trên môi trường thạch đĩa: có thể cấy truyền trên đĩa petri theo một trong các cách sau:
o Tay trái cầm đĩa môi trường, khử trùng nơi định mở trên ngọn lửa đèn cồn, dùng ngón tay cái và ngón giữa tay trái đẩy nắp hộp lồng lên.
o Tay phải cầm que cấy lấy một vòng mẫu, ria cấy trên môi trường theo phương pháp cấy cạn dần (hình 1).
o Đậy nắp môi trường, đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
Hình 2.7: Cách cấy truyền trên môi trường đĩa thạch
(1)Cấy lấy giống, (2) Cách ria cây, (3) Kết quả sau 24 – 48 giờ nuôi cấy
- Cách 2
Hút 0,1ml dịch cấy, nhỏ lên đĩa petri có môi trường dinh dưỡng đặc Dùng que trang gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa
- Cách 3
Hút 0,1ml dịch cấy, nhỏ lên đĩa petri có môi trường dinh dưỡng đặc ở
nhiệt độ50 C
Lay nhẹ đĩa thạch theo chiều đông-bắc,tây-nam cho vi khuẩn phân bố đều trong môi trường thạch còn nóng.
Đặt vào tủấm ở nhiệt độ thích hợp 28−30 C, thời gian 24 – 48giờ.
c. Cấy truyền trên môi trường thạch ống [2][9]
Khi cấy truyền thì tay trái cầm ống nghiệm, phần dưới ống nghiệm nằm trong lòng ngón tay và bàn tay. Mỗi lần cầm nhiều nhất là 3 ống, trong đó 1
kim loại để khử trùng. Dùng tay phải mở nút bông bằng cách kẹp giữa ngón tay rồi hơ và xoay tròn miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng bỏng mới thôi. Dí đầu que cấy đã nguội vào ống giống và gạt nhẹ chỗ có giống mọc tốt đem vạch lên ống thạch mới từ dưới lên theo đường hình chữ
chi hoặc vòng xoắn (hình 2.8: d, g, h)… sao cho đầu que cấy không chạm vào
ống nghiệm còn nóng. Khi 2 ống đã cấy xong thì ta hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn rồi đậy nút bông lại. Các que cấy đã cấy xong cần được đốt cho vô trùng. Muốn cấy vi khuẩn kỵ khí ta dùng que cấy hình kim tiêm sâu vào môi trường. Các bình, dụng cụ chứa môi trường có vi khuẩn mới cấy cần
được đưa ngay vào tủ ấm có bộ phận điều nhiệt và điều chỉnh nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng. Thông thường duy trì nhiệt độ thích hợp là 20−30 C, thời gian 24 – 48giờ.
Hình 2.8: Một số dụng cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn
(a) Que cấy vòng, (b) Que cấy hình kim, (c) Pipet Pasteur, (d, g, h) một số
kiểu cấy, (i) Cấy vi khuẩn kỵ khí bằng qua cây hình kim
Nhận xét kết quả: Nhận xét hình thái khuẩn lạc: màu sắc, kích thước, dạng: S (Smooth) - nhẵn, bóng hay dạng R (Rough) - nhăn nheo, hoặc dạng M (Mucoid) - nhầy nhớt.
d. Những điểm cần lưu ý
Môi trường đặc phải có bề mặt khô, phẳng. Nếu ống môi trường còn
đọng nước cần dựng ống mới cấy vào giá ống nghiệm, tránh nước làm hoen vết cấy.
Khi tiến hành cấy truyền tránh chạm đầu que cấy dùng để lấy vi khuẩn vào bất cứ vật gì.
Nếu dịch vi khuẩn cấy truyền rơi xuống mặt bàn cần lau ngay bằng panh kẹp bông thấm cồn hoặc nước sát trùng.
Nếu bình nuôi quá to cần có người phụ giúp trong việc kéo, dậy nút bông…
Khi cấy truyền vi khuẩn người ta dùng tay trái cầm hai ống nghiệm; ống có vi sinh vật ở xa và ống môi trường ở gần người thao tác. Trước và sau khi cấy truyền xong phải hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng que cấy.²
e. Phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn
Phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn, ta tẩm dung dịch nano bạc vào một đĩa giấy ở nồng độ nhất định, rồi đặt đĩa có tẩm đó lên mặt môi trường thạch có cấy vi khuẩn thử nghiệm trước đó. Dung dịch nano bạc sẽ nhanh chóng khuếch tán trên môi trường thạch ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tuỳ thuộc