Thành phần hóa học

Một phần của tài liệu NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẲN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ PHẦN LẬP | PHÂN ĐOẠN CÁC CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CỦA CÂY | THẦU DẦU (RJCINUS COMMUNIS) TẠI QUẢNG NAM | (Trang 31)

6. Bố cục của luận văn

1.2.4. Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của cây thầu dầu tía đƣợc khám phá qua nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới. Thành phần hóa học chủ yếu của thầu dầu gồm alkaloids, flavonoid, terpenes, saponin, các hợp chất phenolic nhƣ kaempferol, axit gallic, ricin, rutin, lupeol, axit ricinoleic, pinene,…[21].

Một số chất tiêu biểu [7]:

Nhóm Sterol gồm có Campesterol, gama-sitosterol và stigmasterol; các cấu tử này chiếm hàm lƣợng cao trong rễ cây thầu dầu. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất Phytosterol có ích trong việc ức chế ung thƣ phổi, dạ dày và ung thƣ vú. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Phytosterol có thể ức chế hấp thụ Cholesterol, làm giảm nồng độ Cholesterol trong máu và giảm nguy cơ bệnh tim mạch.

* Stigmasterol

O H

O H H H H H * Campesterol H H H H O H * Vitamin E O H C H3 R3 R2 R1 3 * Ethanon, 1- (2-hydroxy-4-metoxyphenyl) O O O H

* n-hexadecanoic axit (Palmitic Acid)

O

OH

O

O H

* 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)- (Axit linoleic)

O O H * Phytol H O * 3-Pyridinecarbonitrile-1,2-dihydro-4-methoxy-1-methyl-2-oxo-(Ricinine) N O CH3 C CH3 O N * 1,2,3-Benzenetriol (Tamin) OH OH HO * Furfural O O

1.2.5. Một số bài thuốc chữa bệnh từ cây thầu dầu

dấm ăn 10ml. Trƣớc tiên lấy rễ thầu dầu đỏ sắc lấy 150ml nƣớc, bỏ bã và cho trứng gà vào khi nƣớc đang còn nóng, đồng thời cho luôn cả dấm rồi đun tiếp. Ăn trứng uống nƣớc canh. Mỗi ngày cần ăn hết 1 liều này. Ăn liên tục 7 – 10 ngày là một liệu trình [3].

- Chữa đau đầu do cảm: lấy lá thầu dầu tía đắp lên trán và 2 bên thái dƣơng, một lát sau sẽ thấy đầu nhẹ giảm hay khỏi đau.

- Làm thuốc để tẩy nhẹ: lấy dầu hạt thầu dầu 10-30g, uống vào lúc đói, chỉ cần sau 3-4 giờ là sẽ đi tiêu nhiều lần mà không bị đau bụng. Nếu muốn tẩy mạnh chỉ cần tăng liều dầu hạt thầu dầu lên 30-50g thì sẽ đi đại tiện kéo dài 5-6 giờ liền [4].

- Chữa sa tử cung và trực tràng: lấy hạt thầu dầu giã nát sau lấy đắp lên đầu. - Sinh khó hay sót nhau: lấy hạt thầu dầu 14 hạt, giã nát đem rịt vào lòng bàn chân cả 2 bên, nhƣng khi đã sinh xong hay nhau sót đã ra hết phải tháo bỏ ngay thuốc ra và rửa sạch lòng bàn chân nơi đã đắp thuốc [8].

- Chữa liệt thần kinh mặt: lấy hạt thầu dầu giã nát đắp vào phía mặt nơi đối diện.

- Chữa hen suyễn: Dùng lá thầu dầu tía 12 gam, phèn phi 8 gam; hai vị tán nhỏ, nhồi với 160 gam thịt lợn giã nhỏ, làm viên chả, gói lá sen non, đun nhỏ lửa nấu chín mà ăn.

- Chữa viêm tuyến vú: Hái lá thầu dầu tƣơi, giã nát, chƣng với giấm đắp vào chỗ bệnh; ngày đắp 2 lần.

- Chữa lở ngứa ngoài da: Dùng lá thầu dầu nấu nƣớc tắm rửa.

- Chữa phong thấp viêm khớp đau nhức, chân tay mỏi: Dùng rễ thầu dầu 12 gam, dây đau xƣơng 20 gam, lõi thông 15 gam, sắc nƣớc uống trong ngày [2].

- Hạt thầu dầu giã nhỏ, chế thành thuốc cao dán để chữa viêm hạch cỏ, viêm tuyến vú, thuốc cao dán gồm nhân hạt thầu dầu kết hợp với ngũ bột tử theo tỉ lệ 98:2, dán vào huyệt bách hội có thể chữa sa dạ dày [3].

CHƢƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ

2.1.1. Nguyên liệu

Các bộ phận của cây thầu dầu tía thu hái vào tháng 8 năm 2018 tại Hội an, Quảng Nam đƣợc thể hiện trên hình 2.1.

Hình 2.1. Cây cây thầu dầu tía và các bộ phận thu hái từ cây thầu dầu tía

Nguyên liệu thô sau thu hái đƣợc rửa sạch, để khô trong không khí, nghiền mịn, bảo quản trong bao polyetylene và đựng trong hộp có nắp, để nơi râm mát theo quy định bảo quản bột dƣợc liệu

2.1.2. Hóa chất

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (P), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu của luận văn này đƣợc đƣa ra trên bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong luận văn

STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc

1 Hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc 2 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc 3 Ethanol 96% Tinh khiết TCCS Trung Quốc 4 Diclometan Tinh khiết TCCS Trung Quốc 5 H2SO4 (98%) Tinh khiết TCCS Trung Quốc 6 (Bi(NO3)3.H2O 98% TCCS Trung Quốc

7 KI Tinh khiết TCCS Trung Quốc

8 HCl đặc Tinh khiết TCCS Trung Quốc 9 HgCl2 Tinh khiết TCCS Trung Quốc 10 NaOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc

11 AgNO3 99,8% TCCS Trung Quốc

13 Vanillin Tinh khiết TCCS Trung Quốc 14 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc 15 Fe2(SO4)3 Tinh khiết TCCS Trung Quốc 16 CH3COOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc 17 KOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc 18 Formol 36% Tinh khiết TCCS Trung Quốc 19 Na2SO4 Tinh khiết TCCS Trung Quốc

Sắc ký lớp mỏng dùng loại đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554).

Sắc ký cột sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm).

2.1.3. Dụng cụ và thiết bị

Tủ sấy, lò nung, cân phân tích 3 số, bếp cách thủy, bếp điện, cốc thủy tinh, phễu chiết, ống đong, pipet, giấy lọc, cột sắc ký và các dụng cụ thí nghiệm khác.

- Đèn UV bƣớc sóng 254 và 365 nm.

- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 100 Perkin Elmer. - Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS LAMBDA25. - Máy sắc ký kết hợp khối phổ GC – MS.

2.2. KHẢO SÁT KHỐI LƢỢNG CAO CHIẾT VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN KHÁNG KHUẨN

2.2.1. Khảo sát khối lƣợng cao chiết trong mỗi loại nguyên liệu

* Nguyên liệu: Bột lá Thầu dầu của cây lá to, lá nhỏ; Bột rễ Thầu dầu của cây lá to, lá nhỏ; Bột cành, thân Thầu dầu của cây lá to, lá nhỏ.

* Tiến hành: Cho vào 4 bình tam giác nút nhám mỗi bình 100g bột nguyên liệu các loại, thêm vào 800ml ethanol 80o, chiết 3 lần, mỗi lần 24 giờ. Dịch chiết đƣợc cô đuổi dung môi đến cao khô, cân đến khối lƣợng không đổi.

2.2.2. Thử hoạt tính kháng khuẩn

Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán qua giếng thạch với các chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) tại Phòng Nghiên Cứu Vi Sinh – khoa Sinh – Đại học Sƣ Phạm – Đại học Đà Nẵng.

- Dịch chiết từ bột các bộ phận cây thầu dầu trong dung môi ethanol 80o. - Một số chủng vi sinh vật kiểm định.

* Kiểm định khả năng kháng khuẩn gây bệnh

Vi khuẩn Gram (-) : Escherichia coli;. Salmonella typhi.

Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis.

* Hóa chất

- Môi trƣờng dùng để nuôi cấy vi khuẩn: Môi trƣờng cao thịt pepton - Cao thịt: 3g/l. - NaCl: 5g/l.

- Agar: 10g/l. - Nƣớc cất: 1000ml. - Pepton: 10g/l. - pH : 7,0

* Dụng cụ

- Pipet. - Ống nghiệm. - Bông không thấm nƣớc. - Tử cây vi sinh. - Tủ ủ, tủ lạnh. - Cốc thủy tinh.

- Đèn cồn. - Máy quang phổ.

- Đĩa peptri. - Que cây, que gắp. - Dụng cụ chiết. - Giá để ống nghiệm. - Đũa thủy tinh. - Máy hiệu chỉnh pH.

Hình 2.2. Buồng cấy vi sinh vô trùng (a) và đĩa peptri đã được đỗ môi trường cấy vi sinh(b)

Nguyên tắc: Ức chế tăng trƣởng của vi sinh vật chỉ thị bằng dịch chiết từ các bộ phận của cây thầu dầu. Kiểm tra bằng khả năng khuếch tán qua giếng thạch.

Cách thực hiện:

- Trên môi trƣờng agar trải vi sinh vật chỉ thị vào. - Dùng ống nhôm đục 2 lỗ thạch đƣờng kính 8 mm.

- Lấy 0,1ml dịch chiết các bộ phận cây thầu dầu cho vào hai lỗ.

- Cho vào tủ lạnh 4oC trong thời gian 5 -6 giờ để dịch chiết khuếch tán ra môi trƣờng.

- Ủ hiếu khí trong tủ ấm với nhiệt độ và thời gian phù hợp với từng vi sinh vật.

- Quá trình đục lỗ: Tất cả quá trình thực hiện bên trong tủ cấy vô trùng, mở nắp đĩa peptri, dùng ống nhôm đƣờng kính 8mm khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn. Đục lỗ thạch. Đậy nắp đĩa lại.Hơ qua ngọn lửa đèn cồn và bảo quản bằng màng bọc thực phẩm.

2.3. PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THU NHẬN CÁC MẪU CAO CHIẾT 2.3.1. Phƣơng pháp ngâm dầm (chiết rắn – lỏng) điều chế tổng cao ethanol 2.3.1. Phƣơng pháp ngâm dầm (chiết rắn – lỏng) điều chế tổng cao ethanol

a. Mục đích:Ngâm chất rắn (đã đƣợc nghiền nhỏ) vào dung môi thích hợp ở nhiệt độ và thời gian xác định. Sau đó lọc lấy phần dung dịch rồi cô đuổi dung môi ở áp suất thấp nhằm mục đích lấy lƣợng chất có khả năng hòa tan trong dung môi đó. Có thể lặp lại vài lần để lấy hết lƣợng chất

b. Cách tiến hành:Lấy 1500g bột mẫu nghiên cứu ngâm chiết bằng ethanol 96o ở nhiệt độ phòng, thời gian ngâm chiết 24 giờ, sử dụng máy khuấy (hoặc lắc đều sau mỗi 15 phút) để đảm bảo cho sự khuyếch tán tốt. Lọc gạn lấy phần dịch chiết rồi tiếp tục lọc qua giấy lọc trên phễu Buschle. Lặp lại 4 lần, lần đầu dùng 10 lít ethanol, những lần sau mỗi lần dùng 5 lít ethanol. Gộp các dịch chiết và cô đuổi dung môi dƣới áp suất thấp thu đƣợc tổng cao ethanol của mẫu nghiên cứu. Cân xác định khối lƣợng cao thu đƣợc và tính % khối lƣợng cao chiết so với khối lƣợng mẫu ban đầu.

c. Tính toán kết quả:Hàm lƣợng tổng cao ethanol đƣợc tính theo công thức:

% mcao ethano l = x 100 mcao ethanol

2.3.2. Phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng tách các phân đoạn cao từ tổng cao ethanol

a. Mục đích:

Tổng cao ethanol thu đƣợc chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực. Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng đƣợc áp dụng để phân chia các chất có trong đó thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.

Hình 2.3. Sơ đồ nguyên tác chiết lỏng - lỏng

Dùng các dung môi có tính phân cực khác nhau để phân tách và thu nhận các loại cao chứa các nhóm hợp chất có độ phân cực khác nhau từ tổng cao ethanol (chứa hầu nhƣ tất cả các hợp chất hữu cơ của trong mẫu)

b. Cách tiến hành:Lấy cao ethanol (50 – 200g) thu đƣợc đem phân tán vào 200 – 300ml nƣớc cất (vì cao ethanol khó tan ngay trong nƣớc nên ban đầu ta hòa nhuyễn bằng 20ml ethanol 960, sau đó thêm dần nƣớc, dùng đũa thủy tinh hay thìa inox loại nhỏ khuấy đều để cao phân tán đều trong nƣớc) rồi cho vào bình thủy tinh có nút kín loại 1 lít. Sau đó tiến hành chiết lỏng- lỏng lần lƣợt với 3 dung môi có độ phân cực tăng dần là hexane, dichloromethane và ethyl acetate. Mỗi loại dung môi chiết 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi, thời gian lắc chiết mỗi lần là 3 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi chuyển vào phễu chiết, khi thấy tách lớp hoàn toàn (chừng 1 – 2 giờ), chiết riêng phần dung môi và phần dịch nƣớc, xác định thể tích phần dung môi (bằng ống đong), cho vào chai chứa loại 500ml, làm khan bằng cách thêm vào 1 thìa Na2SO4 khan, lắc nhẹ, để lắng rồi trích mẫu thử. Gộp dịch chiết của cả 3 lần (với từng dung môi), cô đuổi dung môi dƣới áp suất thấp thu đƣợc phân đoạn cao hexane, cao dichloromethane, cao ethyl acetate và cao nƣớc từ cao tổng ethanol.

đƣợc tính theo công thức:

2.4. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN NHÓM CHỨC VÀ ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT TỪ DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT TỪ TỔNG CAO ETHANOL

2.4.1. Phân tích định tính thành phần nhóm chức các phân đoạn cao chiết từ tổng cao ethanol

a. Định tính alkaloid

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15 ml dung dịch HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.

- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt thuốc thửMayer, nếu xuất hiện kết tủa trắng là phản ứng dƣơng tính.

- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt thuốc thửDragendorff, nếu xuất hiện màu cam đỏ là phản ứng dƣơng tính.

- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Wagner, nếu xuất hiện kết tủa màu cam nâu là phản ứng dƣơng tính.

b. Định tính flavonoid

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15 ml methanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.

- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt axit sunfuric đậm đặc, đun trong bình cách thủy vài phút, dung dịch xuất hiện màu đỏ hoặc hồng là phản ứng dƣơng tính.

- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt NaOH 1%/etanol, nếu xuất hiện màu đỏ nâu hoặc đỏ tím là phản ứng dƣơng tính.

- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt AlCl3/etanol 1%, nếu xuất hiện màu xanh lục là phản ứng dƣơng tính.

c. Định tính terpenoid - steroid

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15 ml clorofom, khuấy đều, lọc qua giấy lọc,lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.

- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch đổi sang màu đỏ % mcao phân đoạn = x 100

mcao phân đoạn mcao ethanol

đậm hoặc xanh tímlà phản ứng dƣơng tính.

- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt dung dịch vanillin 1% trong etanol, 1 giọt HCl đậm đặc. Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh lục hoặc tímlà dƣơng tính.

- Ống 3: thêm vào 2 giọt anhidric acetic rồi thêm vào tiếp 2 giọt H2SO4 đậm nếu dung dịch chuyển sang màu xanh lục hoặc cam đỏ là phản ứng dƣơng tính.

d. Định tính glycosid

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%, đun cách thủy đến khô. Hòa tan cặn trong 5ml clorofom. Lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính.

- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Keller-Kilian (100ml axit axetic loãng + 1 ml Fe2(SO4)3 5%) và 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc. Nếu xuất hiện màu xanh lục sau 1-2 phút là phản ứng dƣơng tính.

- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Tollens, nếu xuất hiện kết tủa bạc là phản ứng dƣơng tính.

- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Phenol–H2SO4, nếu dung dịch chuyển sang màu nâu là phản ứng dƣơng tính.

e. Định tính phenol

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml ethanol, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.

- Ống 1: thêm vào 1 ml vanilin 1% trong HCl, dung dịch chuyển sang màu trầm đậm hoặc đỏ là phản ứng dƣơng tính.

- Ống 2: thêm vào 1ml dung dịch FeCl3 5% trong ethanol. Nếu xuất hiện trầm hiện màu đỏlà phản ứng dƣơng tính.

- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Bortrager (KOH 50%/methanol). Nếu xuất hiện màu đỏ, tím hoặc xanh lục là phản ứng dƣơng tính.

f. Định tính tanin

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml ethanol, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.

- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Gelatin mặn (NaCl 5g + gelatin 0,5 g hòa tan trong 100 ml nƣớc cất). Nếu xuất hiện trầm hiện màu vàng dƣơng tính.

- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Stiasny (formol 36% 20 ml + HCl đậm đặc 10 ml). Nếu xuất hiện trầm hiện màu đỏ là phản ứng dƣơng tính.

g. Định tính sesquyterpen-lacton

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml chloroform, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào ống nghiệm 5ml dịch lọc, thử bằng thuốc thử Tollen, nếu có lớp gƣơng bạc bám trên thành ống nghiệm hoặc có kết tủa Ag màu đen dƣới đáy ống nghiệm thì phản ứng dƣơng tính.

2.4.2. Định danh thành phần hóa học các phân đoạn cao chiết từ tổng cao ethanol bằng phƣơng pháp GC/MS ethanol bằng phƣơng pháp GC/MS

a. Mục đích

Sàng lọc và định danh các chất có phân tử lƣợng thấp và dễ bay hơi có trong

Một phần của tài liệu NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẲN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ PHẦN LẬP | PHÂN ĐOẠN CÁC CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CỦA CÂY | THẦU DẦU (RJCINUS COMMUNIS) TẠI QUẢNG NAM | (Trang 31)