6. Bố cục của luận văn
2.5.2. Phƣơng pháp sắc ký cột
a. Mục đích: Sắc ký cột dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất.
b. Cách tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị cột sắc ký, bình hứng, chất hấp thu và m u cao + Chuẩn bị cột sắc ký:
Hình 2.7. Các cột sắc ký dùng cho sắc ký cột
(a): d=5cm và h=50cm; (b): d = 1.5 cm và h = 45 cm; (c): d = 1.0 cm và h = 45 cm
Tùy theo lƣợng cao mà ta sử dụng cột sắc ký thích hợp. Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng bông thủy tinh để chặn silicagel không bị chảy xuống khi giải ly.
+ Chuẩn bị bình hứng:
Hình 2.8. Các bình hứng dung dịch giải ly
+ Chuẩn bị chất hấp thu silicagel: Chất hấp thu dạng sệt đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: cho chất hấp thu vào trong một becher đã có sẵn dung môi, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa khuấy đều nhẹ nhàng. Lƣu ý không đƣợc thực hiện ngƣợc lại, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất. Lƣợng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không đƣợc quá sệt sẽ khiến cho bọt khí bị giữ lại trong cột và cũng không đƣợc quá loãng.
+ Chuẩn bị m u: Nếu mẫu ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lƣợng nhỏ dung môi thích hợp nhƣ methanol/ethanol rồi trộn với một lƣợng silicagel tƣơng đƣơng. Làm bay hơi dung môi ban đầu bằng cách để khô tự nhiên (hoặc cô quay chân không) và làm khô trong bình phòng ẩm chừng qua đêm (đƣợc bột silicagel đã tẩm mẫu dạng khô), sau đó lấy ra, nghiền mịn bằng cối chày sứ loại nhỏ, để khô lại trong bình phòng ẩm trƣớc khi dùng. Khi đó mẫu cần sắc ký đã đƣợc trải đều và gắn chặt lên bề mặt các hạt silicagel.
Bước 2: Đưa chất hấp thu lên cột (nhồi cột)
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi hexane (loại kém phân cực nhất) vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Dùng thìa inox cho chất hấp thu vào trong cột, đều đặn các phía, mỗi lần một lƣợng nhỏ, khi lƣợng chất cho vào cột mỗi lần cao thêm khoảng 2 cm thì gõ nhẹ đều vào thành cột ở cả 4 phía. Khi lớp dung môi dâng cao cách miệng cột chừng 10 cm thì mở nhẹ khoá ở bên dƣới cột để cho dung môi chảy ra (hứng vào một bình hứng phía dƣới cột và dung môi này sẽ đƣợc rót lại lên đầu cột). Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang.
Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng thìa inox thẳng gạt xoay nhẹ để làm phẳng lớp chất hấp thu phần trên đầu cột. Tiếp tục cho dung môi chảy qua chất hấp thu (hứng lấy và cho lên trở lại) vài lần đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Bước 3: Đưa m u lên cột
+ Với mẫu khô, mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho lƣợng dung môi đủ để thấm ƣớt hoàn toàn lƣợng mẫu cho vào,đóng khoá lại.Để bắt đầu nạp mẫu vào đầu cột ta dùng thìa inox loại nhỏ múc từng thìa cho vào cột qua một phễu hứng thủy tinh cho đến khi hết. Cần canh chừng không cho mẫu và chất hấp thu đầu cột bị khô. Cho thêm một lớp silicagel sạch lên trên mặt thoáng của mẫu, dùng bông thủy tinh, bông gòn hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt trên của cột.
+ Nếu mẫu ƣớt, mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột. Sử dụng một pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng của chất hấp
thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu. Mở khoá bên dƣới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu đƣợc thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột (cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô). Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột. Lặp lại vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu.
Bước 3: Chạy sắc ký cột (giải ly sắc ký cột)
Sử dụng kết quả bản mỏng để lựa chọn dung môi giải ly phù hợp (dung môi làm cho các chất có mặt trong mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau nhất một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/3 – 2/3 chiều dài bản sắc ký). Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
Khi sử dụng pha tĩnh là silicagel loại thƣờng, hợp chất không phân cực đƣợc giải ly khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với phân tử nhỏ, và cũng có khi nó còn ở lại lâu hơn trong cột so với vài phân tử tuy có tính phân cực thấp nhƣng có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn. Có 2 kiểu giải ly:
+ Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhƣng trong hỗn hợp tỷ lệ giữa các thành phần không thay đổi, để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn toàn.
+ Giải ly với dung môi có tính phân cực tăng dần: đôi khi việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột. Nếu muốn lấy chúng ra khỏi cột phải dùng một dung môi có tính phân cực mạnh hơn.Trong quá trình sắc ký, cần thay đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có độ phân cực tăng dần để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi cột. Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm. Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm “gãy’ cột. Cột “gãy” sẽ làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt đƣợc.
Dung dịch giải ly đƣợc hứng trong các bình thủy tinh nhỏ có đánh số thứ tự trƣớc. Hứng mỗi lọ một thể tích nhƣ nhau, thƣờng là 15ml. Dung dịch trong những lọ hứng sẽ đƣợc cho bay hơi bớt dung môi rồi tiến hành kiểm tra vết chất bằng sắc kýbản mỏng. Những lọ nào có vết sắc kýgiống nhau sẽ đƣợc gom lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất thấp sẽ thu đƣợc cao của phân đoạn đó.
Chọn phân đoạn để tiếp tục khảo sát
Chọn phân đoạn có lƣợng cao nhiều và có hợp chất cần phân lập để tiếp tục khảo sát. Các phân đoạn có lƣợng cao ít, nhiều tạp chất, bản mỏng có nhiều vết mờ, dính với nhau hoặc kéo đuôi rất khó khảo sát tiếp, vì nếu cô lập đƣợc chất tinh khiết sẽ không đủ lƣợng mẫu để khảo sát cấu trúc hóa học bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại.
2.5.3. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)
Phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (viết tắc là GC - MS hoặc GCMS) dựa trên cơ sở mối ghép máy sắc ký khí (gas chromatography) và khối phổ (mass spectrometry). Phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp hai kỹ thuật này các nhà hóa học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lƣợng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, ngƣời ta ứng dụng ký thuật GC – MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành y học, môi trƣờng, nông sản, kiểm nghiệm thục phẩm
Các bộ phận chính của máy khối phổ:
Bộ phận nhận và xử lý mẫu
Buồng ion hóa
Bộ phận phân tích tử
Bộ phận tập hợp ion và phóng đại
Bộ phận ghi
* Nguyên lý hoạt động của máy sắc ký khí kết hợp khối phổ
Dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ đƣợc tiêm vào hệ thống tại cửa tiên mẫu. Mẫu sau đó đƣợc dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thƣờng là helium, nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu sẽ đƣợc nâng lên 30000C để mẫu trở thành dạng khí. Phần vỏ ngoài
(oven) của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt. Nhiệt độ của lò này dao động từ 40o
C – 3200C. Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt trong đƣợc tráng bằng một loại polimer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp đƣợc phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.
Sau khi đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ, ở đây chúng bị ion hóa, sau đó tới bộ phận lọc. Dựa trên khối lƣợng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lƣợng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm ứng có nhiệm vụ đếm số lƣợng các hạt có cùng khối lƣợng. Thông tin này sau đó đƣợc chuyển đến máy tính và xuất ra kết quả gọi là phổ khối. Phổ khối là một phổ đồ phản ánh các ion với khối lƣợng khác nhau đi qua bộ phận lọc. Máy tính là bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đƣa ra kết quả khối phổ.
Ta so sánh kết quả khối phổ thu đƣợc trong thí nghiệm với một thƣ viện phổ của các chất đã đƣợc xác định trƣớc. Nếu tìm đƣợc chất tƣơng ứng trong thƣ viện thì ta có thể định danh đƣợc chất đó. Nếu phép so sánh không tìm ra đƣợc kết quả tƣơng ứng, ta thu đƣợc một dữ liệu mới và đóng góp vào thƣ viện cấu trúc sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định đƣợc chính xác loại hợp chất mới này.
Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
Hình 2.9. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
Cô đuổi dung môi
Thầu dầu tía
Làm sạch, phơi khô, nghiền
Mẫu Thầu dầu tía đã xử lý sơ bộ
Gộp dịch chiết ethanol
- Ngâm dầm với ethnol - Chiết rắn – lỏng
Tổng cao ethanol
Cô đuổi dung môi
- Phân tán vào nƣớc
- Chiết lỏng – lỏng với n- hexane
Cao n- hexane Dịch chiết
n- hexane
Dịch nƣớc Cô đuổi
dung môi
Chiết với ethyl acetate
Dịch chiết ethyl acetate Dịch nƣớc
Cao ethyl acetate Cô đuổi dung môi Cao nƣớc chức và định danh Định tính nhóm thành phần hóa học Các phân đoạn cao n-hexane Định danh các cấu tử SKBM SKC GC-MS
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH LƢỢNG CAO VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC TỔNG CAO ETHANOL KHUẨN CỦA CÁC TỔNG CAO ETHANOL
3.1.1. Kết quả khảo sát khối lƣợng cao chiết ethanol từ các bộ phận của cây thầu dầu tía cây thầu dầu tía
Kết quả khảo sát khối lƣợng cao chiết trong mỗi loại nguyên liệu đƣợc trình bày tại bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khổi lượng cao chiết mỗi loại nguyên liệu
STT Loại nguyên liệu lƣợng mẫu Khối Khối lƣợng cao chiết % Khối lƣợng cao chiết
1 Lá thầu dầu tía 100g 13,80g 13,8%
2 Cành thầu dầu tía 100g 6,05g 6,05%
3 Thân thầu dầu tía 100g 3,94g 3,92%
4 Rễ thầu dầu tía 100g 8,32g 8,32%
Nhận xét:Hàm lƣợng cao chiết đối với các bộ phận của cây thầu dầu tía là: lá (13,8%) > rễ (8,32%) >cành (6,05%) > thân (3,92%). Lƣợng cao chiết đƣợc đối với nguyên liệu lá của cây thầu dầu tía là lớn nhất và đối với thân của cây thầu dầu tía là nhỏ nhất. Tuy nhiên, trong lá của cây thầu dầu tía có chứa nhiều thành phần diệp lục tố nên có hàm luợng cao nhất so với các bộ phận còn lại của cây.
3.1.2. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết ethanol củatừ các bộ phận của cây thầu dầu tía củatừ các bộ phận của cây thầu dầu tía
Hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán qua giếng thạch với các chủng vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis và Gram (-) : Escherichia coli;. Salmonella typhi.
a. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol từ lá thầu dầu tía
đƣợc thể hiện trên hình 3.1
Hình 3.1. Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol lá thầu dầu tía
Nhận xét: Từ kết quả thí nghiệm cho thấy: Không thấy hoạt tính kháng khuẩn của lá cây thầu dầu tía trong dung môi ethanol đối với 3 chủng vi khuẩn kiểm định.
b. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol từ cành thầu dầu tía
Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol cành cây thầu dầu tía đƣợc thể hiện trên hình 3.2
Hình 3.2. Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol cành thầu dầu tía
Nhận xét: Từ kết quả thí nghiệm cho thấy: không có hoạt tính kháng khuẩn của cành cây thầu dầu tía (dung môi ethanol) đối với 3 chủng vi khuẩn kiểm định.
c. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol từ thân cây thầu dầu tía
Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol thân cây thầu dầu tía đƣợc thể hiện trên hình 3.3
Hình 3.3. Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol thân cây thầu dầu tía
Nhận xét: Từ kết quả thí nghiệm cho thấy: Không thấy hoạt tính kháng khuẩn của thân cây thầu dầu tía trong dung môi ethanol đối với 3 chủng vi khuẩn kiểm định.
d. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol từ rễ thầu dầu tía
Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol rễ cây thầu dầu tía đƣợc thể hiện trên hình 3.4
Hình 3.4. Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol rễ cây thầu dầu tía
Nhận xét: Từ kết quả thí nghiệm cho thấy: Hoạt tính kháng khuẩn của rễ thầu dầu tía trong dung môi ethanol đối với 3 chủng vi khuẩn kiểm định thể hiện qua kích thƣớc vòng vô khuẩn cho thấy cao chiết này thể hiện hoạt tính mạnh nhất đối với E.coli(20,1 mm), tiếp đến là S.typhi(13,8 mm), riêng đối với B.subtilis không thấy thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn này.Kết quả này là cơ sở ban đầu cho những nghiên cứu ứng dụng rễ thầu dầu tía trong việc chữa một số bệnh liên quan đến các vi khuẩn gây bệnh.
3.2. KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ TỔNG CAO ETHANOL VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TÁCH TỪ TỔNG CAO ETHANOL TỪ RỄ CÂY THẦU DẦU TÍA ĐOẠN TÁCH TỪ TỔNG CAO ETHANOL TỪ RỄ CÂY THẦU DẦU TÍA
Từ các kết quả về hàm lƣợng cao cũng nhƣ hoạt tính kháng khuẩn của các bộ phận của cây thầu dầu tía ở trên, chúng tối tiến hành đi sâu nghiên cứu phƣơng pháp chiết tách và xác định thành phần hóa học của rễ thầu dầu tía.
3.2.1. Kết quả điều chế tổng cao ethanol bằng phƣơng pháp ngâm chiết
Điều kiện tiến hành: Tổng cao ethanol của rễ thầu dầu tía (1kg, độ ẩm 6,75%) thu đƣợc bằng phƣơng pháp ngâm chiết với ethanol 960, thời gian 24 giờ, nhiệt độ phòng, lặp lại 4 lần. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên hình 3.5 và trình bày trên bảng 3.2.
Hình 3.5. Kết quả điều chế cao ethanol của rễ thầu dầu tía Bảng 3.2. Kết quả điều chế cao ethanol của rễ thầu dầu tía
Số lần chiết V(lit) cho vào V(lit) lấy ra m cao ethanol (g) %m cao ethanol (%) Lần 1 10 5,45 43,35 4,65 Lần 2 5 5,55 16,41 1,76 Lần 3 5 5,13 13,83 1,48 Lần 4 5 5,17 6,80 0,73 Tổng 20 21,30 80,39 8,62
Nhận xét: Hàm lƣợng cao ethanol thu đƣợc từ rễ thầu dầu tía là 8,62% (tính theo mẫu khô kiệt)
3.2.2. Kết quả điều chế các cao phân đoạn từ tổng cao ethanol bằng phƣơng pháp phân bố phƣơng pháp phân bố
Lấy 80,39g cao chiết ethanol thu đƣợc đem phân tán vào trở lại 300ml nƣớc cất. Sau đó tiến hành chiết lỏng- lỏng lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực tăng dần là hexane và ethyl acetate.
Hình 3.6. Chiết phân bố lỏng- lỏng bằng hexane từ cao tổng ethanol
a. Chiết phân bố lỏng - lỏng bằng dung môi hexane