6. Bố cục của luận văn
2.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
a. Mục đích: Sắc ký bản mỏng là một kĩ thuật đƣợc dùng để định tính, thử độ tinh khiết, tách chất trong hỗn hợp và đôi khi để bán định lƣợng các hoạt chất.
b. Cách tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị bản mỏng
Bản mỏng đƣợc mua trên thị trƣờng là loại tráng sẵn silicagel kích thƣớc 20x20 cm hoặc 5x10 cm.
Hình 2.5. Bảng mỏng slicagel Kieselgel 60F254
Với loại kích thƣớc 20x20 cm ta cắt bản mỏng ra thành các bản nhỏ với kích thƣớc cần thiết. Lƣu ýsao cho bản mỏng phải lọt đƣợc vào bình giải ly.Dùng bút chì vạch mức xuất phát cách mép dƣới bản mỏng 1 cm và mức tiền tuyến cách mép
trên 0,5 cm.
Bước 2: Chuẩn bị bình sắc ký và dung môi giải ly
Bình triển khai dạng hình khối trụ (đƣờng kính lớn hơn bề ngang bản mỏng sử dụng). Kích thƣớc của bình và thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hƣởng đến giá trị Rf của mẫu.
Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình. Với sắc kýbản mỏng định tính chỉ cần một thể tích khoảng 10 ml dung môi. Quan sát chiều dày của lớp dung môi không đƣợc cao quá 1 cm vì các vết chấm mẫu trên bản mỏng cách bìa 1 cm.
Trƣớc khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần đƣợc bảo hòa dung môi, thực hiện bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ƣớt tờ giấy lọc. Nếu bình không đƣợc bão hòa dung môi, khi dung môi giải ly là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm ( hình lòng chảo) do dung môi đi ở hai bên cạnh nhanh hơn đi ở giữa bản.
Với mẫu chƣa biết thành phần, chƣa có tài liệu tham khảo, cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau, từ không phân cực đến phân cực: hexan, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol. Dùng một mặt kính đồng hồ đậy kín bình triển khai để dung môi không bị bay ra trong quá trình sử dụng.
Hình 2.6. Các bình triển khai cho sắc ký lớp mỏng Bước 3: Chấm m u lên bản mỏng
Mỗi bản mỏng trƣớc khi chấm mẫu phải hoạt hóa (sấy khô bản bằng máy sấy tóc chừng nửa phút). Dùng vi mao quản nhúng một đầu vào mẫu cao đã đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch vào vi quản. Chấm nhẹ
đầu mao quản chứa dung dịch lên trên bản mỏng tại một điểm cách bản 1 cm.
Lưu ý: Chạm nhẹ vi quản vào bề mặt bản mỏng để chỉ tạo thành một điểm tròn nhỏ (vì nếu chạm lâu, điểm này sẽ lan to và nhìn thấy lỗ trên bề mặt). Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi nhanh không lan thành vết chấm to. Có thể chấm thêm vài lần (2 – 5 lần tùy nồng độ mẫu cao trong dung dịch) lên ngay vết chấm cũ để có vết đậm, rõ, nhƣng đƣờng kính không quá 2 mm. Nếu cần chấm cùng nhiều vết chấm lên một bản thì các vết chấm phải cách đáy bản 1,0 cm, cách đều nhau 1,0 cm và cách hai cạnh bên 0,5 cm.
Bước 4: Triển khaisắc ký giải ly bản mỏng:
Khi cho bản mỏng vào bình triển khai thì phải cầm thẳng đứng bản mỏng rồi mới nhúng vào dung môi trong bình. Khi nhúng vào phải cẩn thận để 2 cạnh bên của bản không chạm vào thành bình, lúc đó vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,2 – 0,5 cm.
Đậy nắp bình triển khai, dung môi sẽ đƣợc hút lên bản bởi lực hút mao dẫn. Theo dõi khi mực dung môi lên đến vạch tiền tuyến đã đƣợc vạch sẵn trƣớc đó (cách đầu bản 0,5 cm) thì lập tức lấy bản ra khỏi bình, sấy khô bằng máy sấy tóc.
Bước 5: Cách hiện hình vết sắc ký
Sau khi kết thúc quá trình sắc ký, phải tiến hành làm hiện hình vết sắc ký bằng các phƣơng pháp hóa học và vật lý phù hợp.
Đối với phương pháp hóa học, phun xịt lên bản mỏng một dung dịch thuốc thử có thể có tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp tạo thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thƣờng.
Công thức pha dung dịch thuốc thử hiện màu (dung dịch vanillin 1% trong axit sunfuaric): cho vào cốc loại 500ml hỗn hợp gồm 200ml CH3OH và 25ml CH3COOH đậm đặc, khuấy đều, sau đó cho từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc vào. Tiếp theo cho 1,2 g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấy đều tay. Dung dịch sau khi pha đƣợc đựng trong bình thủy tinh màu tối, đậy nút kín.
Trong phương pháp vật lý, ta có thể lợi dụng hiện tƣợng phát quang với các tia tử ngoại. Ngoài ra có thể dùng một chất chỉ thị phát quang tác dụng đƣợc với các cấu tử trong hỗn hợp hoặc nhận dạng vết sắc ký bằng phƣơng pháp phóng xạ.
Bước 5: Lựa chọn dung môi phù hợp
Với các tấm bản mỏng có chấm các mẫu chất nhƣ nhau và đƣợc giải ly bằng các dung môi đơn hay dung môi hỗn hợp có độ phân cực khác nhau. Dựa trên các vết chất xuất hiện trên các bản mỏng ta xác định đƣợc dung môi phù hợp để giải ly mẫu:
+ Dung môi là phù hợp khi nó làm cho các chất có mặt trong mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau nhất một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/4 - 3/4 hoặc 1/3 – 2/3 chiều dài bản sắc ký.
+ Những dung môi không phù hợp nếu tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất phát (dung môi đó chƣa đủ phân cực) hoặc tất cả các cấu tử di chuyển lên hết mức tiền tuyến (dung môi đó quá phân cực).
Bước 6: Xác định hệ số di chuyển (Rf)
Sử dụng bản giải ly với dung môi phù hợp nhất, nhận xét về màu sắc và xác định hệ số di chuyển từ giá trị Rf của các vết thu đƣợc. Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = a/b (Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1). Trong đó:
a: là khoảng cách (cm) từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu.
b: là khoảng cách (cm) từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết.
2.5.2. Phƣơng pháp sắc ký cột
a. Mục đích: Sắc ký cột dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất.
b. Cách tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị cột sắc ký, bình hứng, chất hấp thu và m u cao + Chuẩn bị cột sắc ký:
Hình 2.7. Các cột sắc ký dùng cho sắc ký cột
(a): d=5cm và h=50cm; (b): d = 1.5 cm và h = 45 cm; (c): d = 1.0 cm và h = 45 cm
Tùy theo lƣợng cao mà ta sử dụng cột sắc ký thích hợp. Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng bông thủy tinh để chặn silicagel không bị chảy xuống khi giải ly.
+ Chuẩn bị bình hứng:
Hình 2.8. Các bình hứng dung dịch giải ly
+ Chuẩn bị chất hấp thu silicagel: Chất hấp thu dạng sệt đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: cho chất hấp thu vào trong một becher đã có sẵn dung môi, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa khuấy đều nhẹ nhàng. Lƣu ý không đƣợc thực hiện ngƣợc lại, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất. Lƣợng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không đƣợc quá sệt sẽ khiến cho bọt khí bị giữ lại trong cột và cũng không đƣợc quá loãng.
+ Chuẩn bị m u: Nếu mẫu ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lƣợng nhỏ dung môi thích hợp nhƣ methanol/ethanol rồi trộn với một lƣợng silicagel tƣơng đƣơng. Làm bay hơi dung môi ban đầu bằng cách để khô tự nhiên (hoặc cô quay chân không) và làm khô trong bình phòng ẩm chừng qua đêm (đƣợc bột silicagel đã tẩm mẫu dạng khô), sau đó lấy ra, nghiền mịn bằng cối chày sứ loại nhỏ, để khô lại trong bình phòng ẩm trƣớc khi dùng. Khi đó mẫu cần sắc ký đã đƣợc trải đều và gắn chặt lên bề mặt các hạt silicagel.
Bước 2: Đưa chất hấp thu lên cột (nhồi cột)
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi hexane (loại kém phân cực nhất) vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Dùng thìa inox cho chất hấp thu vào trong cột, đều đặn các phía, mỗi lần một lƣợng nhỏ, khi lƣợng chất cho vào cột mỗi lần cao thêm khoảng 2 cm thì gõ nhẹ đều vào thành cột ở cả 4 phía. Khi lớp dung môi dâng cao cách miệng cột chừng 10 cm thì mở nhẹ khoá ở bên dƣới cột để cho dung môi chảy ra (hứng vào một bình hứng phía dƣới cột và dung môi này sẽ đƣợc rót lại lên đầu cột). Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang.
Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng thìa inox thẳng gạt xoay nhẹ để làm phẳng lớp chất hấp thu phần trên đầu cột. Tiếp tục cho dung môi chảy qua chất hấp thu (hứng lấy và cho lên trở lại) vài lần đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Bước 3: Đưa m u lên cột
+ Với mẫu khô, mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho lƣợng dung môi đủ để thấm ƣớt hoàn toàn lƣợng mẫu cho vào,đóng khoá lại.Để bắt đầu nạp mẫu vào đầu cột ta dùng thìa inox loại nhỏ múc từng thìa cho vào cột qua một phễu hứng thủy tinh cho đến khi hết. Cần canh chừng không cho mẫu và chất hấp thu đầu cột bị khô. Cho thêm một lớp silicagel sạch lên trên mặt thoáng của mẫu, dùng bông thủy tinh, bông gòn hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt trên của cột.
+ Nếu mẫu ƣớt, mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột. Sử dụng một pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng của chất hấp
thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu. Mở khoá bên dƣới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu đƣợc thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột (cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô). Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột. Lặp lại vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu.
Bước 3: Chạy sắc ký cột (giải ly sắc ký cột)
Sử dụng kết quả bản mỏng để lựa chọn dung môi giải ly phù hợp (dung môi làm cho các chất có mặt trong mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau nhất một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/3 – 2/3 chiều dài bản sắc ký). Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
Khi sử dụng pha tĩnh là silicagel loại thƣờng, hợp chất không phân cực đƣợc giải ly khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với phân tử nhỏ, và cũng có khi nó còn ở lại lâu hơn trong cột so với vài phân tử tuy có tính phân cực thấp nhƣng có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn. Có 2 kiểu giải ly:
+ Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhƣng trong hỗn hợp tỷ lệ giữa các thành phần không thay đổi, để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn toàn.
+ Giải ly với dung môi có tính phân cực tăng dần: đôi khi việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột. Nếu muốn lấy chúng ra khỏi cột phải dùng một dung môi có tính phân cực mạnh hơn.Trong quá trình sắc ký, cần thay đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có độ phân cực tăng dần để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi cột. Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm. Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm “gãy’ cột. Cột “gãy” sẽ làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt đƣợc.
Dung dịch giải ly đƣợc hứng trong các bình thủy tinh nhỏ có đánh số thứ tự trƣớc. Hứng mỗi lọ một thể tích nhƣ nhau, thƣờng là 15ml. Dung dịch trong những lọ hứng sẽ đƣợc cho bay hơi bớt dung môi rồi tiến hành kiểm tra vết chất bằng sắc kýbản mỏng. Những lọ nào có vết sắc kýgiống nhau sẽ đƣợc gom lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất thấp sẽ thu đƣợc cao của phân đoạn đó.
Chọn phân đoạn để tiếp tục khảo sát
Chọn phân đoạn có lƣợng cao nhiều và có hợp chất cần phân lập để tiếp tục khảo sát. Các phân đoạn có lƣợng cao ít, nhiều tạp chất, bản mỏng có nhiều vết mờ, dính với nhau hoặc kéo đuôi rất khó khảo sát tiếp, vì nếu cô lập đƣợc chất tinh khiết sẽ không đủ lƣợng mẫu để khảo sát cấu trúc hóa học bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại.
2.5.3. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)
Phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (viết tắc là GC - MS hoặc GCMS) dựa trên cơ sở mối ghép máy sắc ký khí (gas chromatography) và khối phổ (mass spectrometry). Phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp hai kỹ thuật này các nhà hóa học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lƣợng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, ngƣời ta ứng dụng ký thuật GC – MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành y học, môi trƣờng, nông sản, kiểm nghiệm thục phẩm
Các bộ phận chính của máy khối phổ:
Bộ phận nhận và xử lý mẫu
Buồng ion hóa
Bộ phận phân tích tử
Bộ phận tập hợp ion và phóng đại
Bộ phận ghi
* Nguyên lý hoạt động của máy sắc ký khí kết hợp khối phổ
Dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ đƣợc tiêm vào hệ thống tại cửa tiên mẫu. Mẫu sau đó đƣợc dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thƣờng là helium, nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu sẽ đƣợc nâng lên 30000C để mẫu trở thành dạng khí. Phần vỏ ngoài
(oven) của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt. Nhiệt độ của lò này dao động từ 40o
C – 3200C. Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt trong đƣợc tráng bằng một loại polimer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp đƣợc phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.
Sau khi đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ, ở đây chúng bị ion hóa, sau đó tới bộ phận lọc. Dựa trên khối lƣợng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lƣợng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm ứng có nhiệm vụ đếm số lƣợng các hạt có cùng khối lƣợng. Thông tin này sau đó đƣợc chuyển đến máy tính và xuất ra kết quả gọi là phổ khối. Phổ khối là một phổ đồ phản ánh các ion với khối lƣợng khác nhau đi qua bộ phận lọc. Máy tính là bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đƣa ra kết quả khối phổ.
Ta so sánh kết quả khối phổ thu đƣợc trong thí nghiệm với một thƣ viện phổ của các chất đã đƣợc xác định trƣớc. Nếu tìm đƣợc chất tƣơng ứng trong thƣ viện thì ta có thể định danh đƣợc chất đó. Nếu phép so sánh không tìm ra đƣợc kết quả tƣơng ứng, ta thu đƣợc một dữ liệu mới và đóng góp vào thƣ viện cấu trúc sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định đƣợc chính xác loại hợp chất mới này.