4. Nội dung nghiên cứu
1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.4.1. Phương pháp chiết
a. Giới thiệu chung
Chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan chất đang cần tách và tinh chế để tách chất đó ra khỏi môi trường rắn hoặc lỏng khác. Thường người ta dùng một dung môi sôi thấp và ít tan trong nước (vì các chất hữu cơ cần tinh chế thường ít tan trong nước), chất đó sẽ chuyển phần lớn lên dung môi và ta có thể dùng phểu để tách riêng dung dịch thu được ra khỏi nước.
Bằng cách lặp đi lặp lại việc chiết một số lần, ta có thể tách hoàn toàn chất cần tinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó cất loại dung môi và cất lấy chất tinh khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp.
Người ta cũng thường chiết một số chất từ hỗn hợp rắn bằng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt gọi là bình chiết Soxhlet. Dung môi được đun nóng, cho bay hơi liên tục chảy vào bình chứa hỗn hợp cần chiết tách (thường gói trong giấy lọc), nó sẽ hòa tan chất rắn cần tinh chế và nhờ một ống xiphông, dung dịch chảy xuống bình cầu bên dưới, dung môi nguyên chất lại liên tục được cất lên. Phương pháp này tiết kiệm được dung môi và hiệu quả tương đối cao [4].
b. Kỹ thuật chiết Soxlet
*Nguyên tắc:
Chiết Soxhlet là một kiểu chiết liên tục đặc biệt thực hiện nhờ một trang bị riêng của nó.Kiểu chiết này cũng như kiểu chiết lỏng-lỏng nên về bản chất của sự chiết vẫn là định luật phân bố chất trong hai pha không trộn vào nhau. Song ở đây pha mẫu là ở trạng thái lỏng, bột, hoặc dạng mảnh hoặc lá. Còn dung môi chiết (chất hữu cơ) là dạng lỏng.
Ví dụ chiết lấy dầu melton từ lá cây bạc hà bằng dung môi hữu cơ n-hexan hay benzen. Chiết các thuốc trừ sâu hoặc bảo vệ thực vật trong mẫu rau quả, mẫu đất bằng n-hexan. Vì thế đây là kiểu chiết của hệ có thể là cả đồng thể và dị thể, mà
19
chất phân tích nằm trong mẫu rắn, bột, lá, sợi[2][3][4].
*Dụng cụ:
Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ. Một bộ phận chứa mẫu bột cây, gồm ba ống : ống D có đường kính lớn, ở giữa, để chứa bột cây, ống B có đường kính trung bình, để dẫn dung môi từ bình A bay lên, đi vào ống D chứa bột cây, ống E có đường kính nhỏ, là ông thông nhau, để dẫn dung môi từ D trả ngược lại bình cầu A. Trên cao nhất là ống C ngưng hơi[4] (hình 1.7).
Hình 1.7. Dụng cụ bộ chiết Soxhlet
Trong đó
A là bình cầu chứa dung môi chiết
B là ống trung bình dẫn dung môi từ bình cầu lên ống lớn C là ống sinh hàn
D là ống lớn đựng bột nguyên liệu
20
*Cách tiến hành
Bột cây xay thô đựng trong một cái túi bằng giấy lọc được đặt trực tiếp trong ống D. Lưu ý đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống D để tránh làm ngẹt lối ra vào của ống thông nhau E. Không được để lượng bột cây trong ống D cao vượt hơn mức cong của ống thông nhau E. Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở nút mài số (2) như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau E.
Kiểm tra hệ thống kín, mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi. Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều. Dung môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống B lên cao hơn, rồi theo ống ngưng hơi để lên cao hơn nữa, nhưng tại đây hơi dung môi bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống D đang chứa bột cây. Dung môi ngấm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi. Theo quá trình đun nóng, lượng dung môi rơi vào ống D càng nhiều,mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng cao trong ống E. Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút vào bình cầu A, lực hút này sẽ rút lượng dung môi đang chứa trong ống D.
Bếp vẫn tiếp tục đun và một qui trình mới vận chuyển dung môi theo như mô tả lúc đầu. Các hợp chất được rút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết.
Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi và thu được cao chiết.
*Ưu, nhược điểm của phương pháp chiết bằng máy Soxhlet
+Ưu điểm:
Tiết kiệm được dung môi, không tốn các thao tác lọc và châm dung môi mới. Chỉ cần cắm điện, mở nước hoàn lưu thì máy sẽ thực hiện sự chiết.
Chiết kiệt hợp chất có trong bột cây vì bột cây liên tục được chiết bằng dung môi tinh khiết.
+Nhược điểm:
Kích thước của máy Soxhlet làm giới hạn bột cây cần chiết. Máy loại lớn nhất với bình cầu 15 lít, có thể chứa một lần đến 10 lít dung môi, ống D có thể chứa 800 gam bột cây xay nhỏ. Với máy nhỏ hơn, chỉ có thể cho vào mỗi lần vài trăm gam bột cây, muốn chiết lượng lớn bột cây cần phải lặp lại nhiều lần.
21
Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột cây được trữ lại trong bình cầu, nên chúng luôn được đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi vì thế nếu có hợp chất nào kém bền nhiệt sẽ bị hư hại.
Do toàn bộ hệ thông của máy đều bằng thủy tinh và được gia công thủ công nên giá thành một máy khá cao. Máy bằng thủy tinh nên dễ vỡ, chỉ cần bể một bộ phận nào đó thì khó tìm được một bộ phận khác có thể vừa khớp để thay thế[6].
1.4.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký cột
a. Sắc ký bản mỏng
Phương pháp này được Izmailop và Schreiber đề nghị từ năm 1938, được Stan phát triển, hoàn thiện năm 1955 và có ứng dụng rộng rãi.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử độ tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng trường hợp. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:
Rf = 𝑎
𝑏
Trong đó:
a: Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu.
b: Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 – 1.
22
ít dung môi, thường được dùng để định tính các hợp chất hữu cơ có trong mẫu, đặc biệt là chọn được hệ dung môi phù hợp dùng để tách các hợp chất hữu cơ có trong mẫu nghiên cứu bằng sắc ký cột.
+ Nhược điểm của kỹ thuật: Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình thực hiện, các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi và chỉ dùng khi hỗn hợp cần tách có số lượng ít, vài trăm miligam, còn nếu mẫu nhiều, vài gam thì tách bằng sắc ký cột sẽ kinh tế hơn[4][6]
Hình 1.8. Hộp bản mỏng có kích thước 5x10cm
b. Sắc ký cột
Sắc ký cột là kỹ thuật phổ thông nhất trong các phòng thí nghiệm. Phương pháp này rất đơn giản và có thể phân lập các hợp chất khỏi hỗn hợp một cách nhanh chóng. Tuy nhiên, giống như nhiều kỹ thuật hóa học thực hành khác, để có thể thiết lập và chạy một cột sắc ký nhanh và hiệu quả lại cần đến nhiều năm kinh nghiệm.
Các cột sắc ký thường được dùng trong các phòng thí nghiệm vô cơ và hữu cơ để loại bỏ các nguyên liệu không phản ứng ban đầu hoặc phân lập một sản phẩm mong muốn khỏi các sản phẩm phụ sau khi phản ứng hoàn thành. Để làm được điều này, hỗn hợp phản ứng được đi qua một ống thủy tinh thẳng đứng, bên trong có nhồi hạt silica hoặc alumina, các chất đi ra được thu lại thành từng phần nhỏ hay phân đoạn nhỏ ở đầu dưới của cột. Các thành phần khác nhau của mẫu được phân tách thành các loại hợp chất khác nhau do tương tác của hỗn hợp với silica.
23
không phân cực nên chúng sẽ đi ra khỏi cột (hoặc rửa giải) chậm hơn so các hợp chất không phân cực. Khi một mẫu có chứa các hợp chất có độ phân cực tương tự nhau, việc phân tách chúng ở các phần nhỏ và thu hồi mẫu sạch sẽ rất khó khăn.
Việc nhồi cột chính xác được cho là yếu tố thực nghiệm quan trọng nhất, bên cạnh đó, một số yếu tố khác có thể tối ưu để có thể đạt khả năng phân tách tốt nhất trong thời gian ngắn nhất[4][6].
1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (LC-MS)
LC/MS là phương pháp được dùng trong phân tích vết (ppb, ppm) các hợp chất cần nhận danh chính xác. Trong những điều kiện vận hành nhất định ngoài thời gian lưu đặc trưng, các chất còn được nhận danh bằng khối phổ của nó [24].
a. Nguyên lý chung
Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hóa bằng các phương pháp thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm(-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn.
Tuy nhiên sự phát triển của kỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thường độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng lẻ.
Trong nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ, trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng.
24
giao diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB)…đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập niên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển ( Atmospheric Pressure Ionization- API)
Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous flow-fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray-TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm, không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: + Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).
+ Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization- APCI).
+ Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure photoionization – APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt ESI được sử dụng nhiều nhất[24].
b. Nguồn ion hóa trong đầu dò khối phổ
- Ion hóa tia điện (ESI)
ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kĩ thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide…hoặc các polymer công nghiệp như polyethylene glycol.
25
Hình 1.9. Hình ảnh sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
Được bắt nguồn từ hệ thống sắc ký lỏng, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn để từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển thành thế khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối.
Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào : dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch. Các dung môi phù hợp để phun sương là: methanol, acetonitrile, ethanol [24].
- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)
APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi.
Trong APCI, ion được hình thành như sau: mẫu hợp chất cần phân tích, hòa tan trong pha động, sau khi ra khỏi cột sắc ký, được cho đi ngang qua ống mao quản đốt nóng. Khi ra khỏi ống, nhờ khí N2, dung dịch được phun thành dạng sương từ đầu ra của nguồn APCI. Các giọt sương nhỏ được một dòng khí dẫn đến một ống thạch anh đun nóng, gọi là buồng dung môi hóa khí. Hợp chất đi theo luồng khí nóng ra khỏi ống để đến một vùng có áp suất khí quyển, nơi đây sẽ xảy ra sự ion