4. Nội dung nghiên cứu
3.4.2. Kết quả phân lập các hợp chất từ dịch chiết bằng LC-MS
Điều kiện chạy LC-MS
Các mẫu cao chiết ứng với các phân đoạn F1, F11 và F12 được pha loãng 4 lần với 10% aq. Acetonitrile (CH3CN) chứa 0.1 % acid formic (HCOOH). Sử dụng 10 μL dung dịch cho mỗi lần chạy LC-MS (ETD).
Pha động: 0.1% HCOOH – 90% CH3CN (0.09% HCOOH) từ 70:30 đến 5:95 trong 15 phút
Tốc độ dòng 0.2 mL/min
Cột: Cadenza C18, chiều dài cột 100 mm Dectector Wavelength: 218 nm
63
Hình 3.22. Phổ LC-MS của các hợp chất có trong phân đoạn F1
Dựa vào phổ LC-MS, cho thấy có 05 đỉnh phân tử ở m/z 422.2 [M+H]+; 452.2 [M+H]+; 480.1[M+H]+; 494.2 [M+H]+; và 534.2 [M+H]+. Dựa vào kết quả phổ LC- MS và so sánh các hợp chất đã được công bố [13] từ cây Lim xanh, một số hợp chất cassaine diterpene alkaloid có mặt trong phân đoạn F1 bao gồm:
m/z 422.2 [M+H]+ là 6a-Hydroxydinorcassamide (B), ứng với công thức phân tử là C23H35NO6
(B)
m/z 452.2 [M+H]+là 3b-Hydroxynorerythrosuamide (A), ứng với công thức phân tử là C24H37NO7
64
(A)
m/z 480.1 [M+H]+ là 3b-Acetoxydinorerythrosuamide(C), ứng với công thức phân tử là C25H37NO8
(C)
Cấu trúc hóa học của hợp chất 3b-Acetoxydinorerythrosuamide
m/z 494.2 [M+H]+ là 3b-Acetoxynorerythrosuamide (D), ứng với công thức phân tử là C26H40NO8
(D)
m/z 534.2 [M+H]+ là 3b-Tigloyloxynorerythrosuamide (E), ứng với công thức phân tử là C29H43NO8
65
(E)
Nhận xét: Đối với các mono cassaine diterpene alkaloid đã được báo cáo trước đó [13], đều được tìm thấy trong phân đoạn F1. Đáng lưu ý với điều kiện chạy RP-HPLC bước đầu khảo sát, các hợp chất này đều có thời gian lưu (rt) khá khác biệt với phổ MS khá sạch, là cơ sở tham khảo cho điều kiện chạy cột sắc ký lỏng pha đảo tiếp theo. Và cần thiết phải kết hợp nhiều phương pháp bao gồm chiết lỏng- lỏng, sắc kí cột silicagel và sắc kí lỏng pha đảo RP-HPLC để có thể phân lập từng mono cassaine diterpene alkaloid riêng biệt.
Đặc biệt với hợp chất F ứng với thời gian lưu rt = 6.5 min với hàm lượng tương ứng khá cao (10.5 %), nhưng chưa được định danh, cụ thể theo hình 3.23
Hình 3.23. Phổ LC-MS của các hợp chất F có trong phân đoạn F1
Đối với phân đoạn F11, lấy 0,5 g cao từ phân đoạn F11 hòa tan trong MeOH để chạy cột sắc kí cột với hệ dung môi M/C/AA với tỷ lệ độ phân cực tăng dần từ 10:70:0,095 đến hệ M/C với tỷ lệ 10:60; 10:50; 10:40; 10:30; 10:20; 10:10 thu được 2 phân đoạn có Rf gần giống nhau có kí hiệu là F12 và F13. Dựa vào bản mỏng, lựa chọn được phân đoạn F12 có vết tròn rõ nhất. Sau đó, phun thuốc thử, cô đuổi dung
66
môi và gởi mẫu đến Phòng thí nghiệm Sinh hoá hữu cơ (Prof. Kajihara’s Laboratory), Khoa Hoá, Đại học Osaka, Osaka, Nhật Bản. Kết quả thu được như
hình 3.24.
Hình 3.24. Phổ LC-MS của các hợp chất có trong phân đoạn F12
Dựa vào phổ LC-MS, cho thấy có 2 đỉnh phân tử ở m/z 773.3 [M+Cl]- và 846.1 [M+Cl]-. Dựa vào kết quả phổ m/z và so sánh các hợp chất đã được công bố [13] ta có :
67
(G)
m/z = 846.1 [M+Cl]- là Erythrophlesin D (H) ứng với công thức phân tử C45H66NO12
(H)
Nhận xét: Phù hợp với các nghiên cứu trước đó, hàm lượng của các dạng dimer của cassaine diterpene alkaloid tách được từ cây Lim xanh khá thấp. Vì vậy lượng chất ban đầu để chiết cần khá lớn để có thể thu được một lượng đáng kể phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.
68
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã xác định được khối lượng cao sau khi chiết phân đoạn tối ưu nhất là chiết với dung môi Cloroform với 4.003 g (chiết với Methanol) và 4.321 g (chiết với ethanol/nước)
2. Định tính các Alkaloid sử dụng 3 loại thuốc thử màu: Mayer, Dragendoff, Wagner với các dịch chiết của từng dung môi. Dung môi Cloroform là dung môi chứa dịch chiết có nhiều alkaloids nhất.
3. Đã xác định được một số hợp chất flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn mạnh trong các dịch chiết n-hexane, cloroform, n-butanol và ethyl acetate của lá cây Lim xanh nhờ vào phổ ESI-MS. Qua đó, giải thích được lí do dịch chiết butanol cho tính kháng khuẩn mạnh nhất mặc dù hàm lượng alkaloid trong dịch chiết butanol không phải cao nhất.
4. Sử dụng kết hợp phương pháp chiết lỏng-lỏng, sắc kí cột silicagel và LC/MS cho phép xác định phân đoạn tách có mặt các cassain diterpene alkaloid nhiều nhất. Các cassaine diterpene alkaloid được tôi định danh từ dịch chiết chloroform của lá cây Lim xanh (Việt Nam) bao gồm 6a-Hydroxydinorcassamide, 3b-Hydroxynorerythrosuamide, 3b-Acetoxydinorerythrosuamide, 3b- Acetoxynorerythrosuamide, 3b-Tigloyloxynorerythrosuamide, Erythrophlesin F, Erythrophlesin D .
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu phân lập riêng lẽ với khối lượng lớn từng Cassaine diterpene alkaloid từ lá cây Lim Xanh (Việt Nam) bằng quy trình đã được tối ưu hoá nêu trong luận văn, đồng thời thử hoạt tính sinh học quan trọng bao gồm điều hoà huyết áp và chống ung thư trên một số dòng ung thư của các hợp chất được phân lập.
2. Tiếp tục có thêm nhiều công trình nghiên cứu trong thời gian đến về các bộ phận khác của cây Lim xanh như rễ, quả và vỏ, tiến đến có các công trình ứng dụng về hiệu quả mang lại từ cây Lim xanh, nhằm góp phần làm tăng giá trị sử dụng của cây Lim xanh được thu hái trên địa bàn thuộc huyện Tiên Phước tỉnh Quảng Nam trong tương lai gần.
3. Bên cạnh alkaloids, lá từ cây lim xanh còn chứa một số hoạt chất phenolic hứa hẹn một số hoạt tính sinh học đáng chủ ý, điển hình là chống oxi hoá. Điều này có thể mở ra một số hướng mới.
69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
[1] Bùi Thị Cúc (2014), Các hợp chất Diterpene phân lập từ cây Na biển, trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2.
[2] Nguyễn Văn Hạnh (2002), Tách chiết và cô lập các hợp chất tự nhiên, giáo trình cao học, NXB ĐHQG thành phố HCM.
[3] Phan Quốc Kinh (2011), Giáo trình Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học , NXB Giáo Dục Việt Nam.
[4] Hồ Viết Quý (2007), Các phương pháp phân tích công cụ hiện đại, NXB Đại học Sư phạm.
[5] Nguyễn Đình Triệu (2006), Các phương pháp phổ trong hóa học hữu cơ và hóa sinh, NXB ĐHQG Hà Nội.
[6] Bùi Xuân Vững (2010), Các phương pháp phân tích công cụ, Khoa Hóa, Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
TIẾNG ANH
[7] Chaw, C.S.; Ralph, M.(2011), Erythrophloeum Fordii Oliver Ecology and Silvicuture in Viet Nam, Center for International Forestry Research (CIFOR), Bogor, Indonesia.
[8] Chen, J. S.; Zhen, S.,(1987) “Chinese Virose Plant”, 1st ed.; Science Press: Beijing; pp.321.
[9] Culvenor, C.C.J., Loder, J.W., Nearn, R., (1971), “Alkaloids of the leaves of Erythrophleum chlorostachys”, Phytochemistry 10, pp.2793–2797.
[10] Cronlund, A., Sandberg, F., (1976), “Cardiotonic effect and toxicity of Erythrophleum alkaloids”. Acta Pharm. Suec. 13, pp.35–42.
[11] Loder, W.; Culvenor, C. C. J.; Nearn, R. H.; Russell, G. B.; Stanton, D. W(1974), “Tumour inhibitory plants. New alkaloids from the bark of Erythrophleum chlorostachys”, Australian Joumal of Chemistry 27, pp.179-185.
[12] Tran, M.H.; To, D. C.; Kim, J.A.; Tae, N.; Lee, J.H.; Min, B.S(2014), “Cassaine diterpene alakloids from Erythrophleum fordii and their anti- angiogenic effect”, Bioorganic and Medicinal Chemistry letters, 24, pp.168-172.
70
[13] (a) Qu, J.; Hu, Y. C.; Yu, S. S.; Chen, X. G.; Li, Y. Planta Med. 2006, 72, 442. (b) Dan Du, D; Qu, J; Wang, J.M; Yu, S.S; Chen, X. G; Song Xu, Ma, S. G;
Li, Y; Ding, G.Z; Fang, L.(2010),”Cytotoxic cassaine diterpenoid- diterpenoid amide dimers and diterpenoid amides from the leaves of Erythrophleum fordii”, Phytochemistry, pp.1749-1755.
[14] (a) Qu, J., Hu, Y.C., Yu, S.S., Chen, X.G., Li, Y., (2006a), “New cassaine
diterpenoid amides with cytotoxic activities from the bark of Erythrophleum fordii”, Planta Med. 72, 442–449.
(b) Qu, J., Yu, S.S., Tang, W.Z., Liu, Y.B., Liu, Y., Liu, J.,(2006b), “Progress on cassaine-type diterpenoid ester amines and amides (Erythrophleum alkaloids)”,
Nat. Prod. Commun, 1, 839–850.
[15] Verotta, L., Aburjai, T., Rogers, C.B., Dorigo, P., Maragno, I., Fraccarollo, D., Giovanni, S., Gaion, R.M., Floreani, M., Carpenedo, F.,(1995), “Chemical and pharmacological characterization of Erythrophleum lasianthum alkaloids”,
Planta Med, 61, 271– 274. INTERNET [16]http://namlim.vn/cong-d%E1%BB%A5ng-n%E1%BA%A5m-lim-xanh/cong- d%E1%BB%A5ng-n%E1%BA%A5m-lim-xanh [17] http://timtailieu.vn/tai-lieu/hoa-hoc-hop-chat-thien-nhien-alkaloid-31559/ [18] http://vafs.gov.vn/vn/2014/07/ky-thuat-trong-lim-xanh-2/ [19] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4178685/ [20] https://en.wikipedia.org/wiki/Cassaine [21]http://cayxanhsaigon.net/cay-cong-trinh/cay-lim-xanh/ [22]http://namlimxanhtunhien.com.vn/cong-dung-nam-lim-xanh/ [23]https://en.wikipedia.org/wiki/Cassaine [24]http://case.vn/vi-VN/34/96/119/details.case [25]https://trinhhaithang.wordpress.com/2016/11/05/ban-luan-ve-lc-ms-phan-1/ [26]http://daotao.vnuk.udn.vn/vnuk/dr-trang-mang-hungs-work-published-sci- academic-journal/