4. Nội dung nghiên cứu
2.7.3. Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp. Sắc kí cột gồm sắc kí cột thường và sắc kí cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel. Đối với các chất có khối lượng phân tử khác nhau có thể sử dụng sắc kí cột Sephadex LH–20. Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp.
*Cách bước thực hiện
Bước 1 : Chuẩn bị cột sắc ký
1. Rửa sạch cột
2. Cho bông gòn vào (1mm) 3. Cho cát đã sấy vào (1mm) 4. Cho bông vào lớp trên tiếp.
41
Bước 2 : Chuẩn bị silicagel để nạp vào cột
1. Lấy cốc thủy tinh có mỏ cho dung môi giải ly vào cốc ( methanol:clorofom: acid acetic 10:70:0,095)
2. Cho silicagel ở dạng khô vào cốc từ từ từng ít một và khuấy đều. Đến khi cho hết silicagel vào cốc thì tiếp tục khuấy đều đến khi hỗn hợp đồng nhất và tương đối hết bọt khí
Bước 3 : Nạp silicagel vào cột sắc ký
1. Mở nhẹ khóa cột sắc ký để cho dung môi có sẵn trong cột chảy ra chầm chậm. Lấy 1 cốc có mỏ hứng dung môi chảy ra để ở bên dưới cột sắc ký
2. Rót chất hấp phụ (silicagel) dạng sệt vừa cân bằng ở trên vào đầu cột đến vị trí theo ý muốn (rót từng lượng ít một ).
- Vừa cho silicagel vừa lấy kẹp gỗ gõ nhẹ vào thành ngoài của cột. - Tiếp tục vừa rót silicagel vào cột vừa gõ nhẹ đến khi rót hết.
- Khi rót silicagel vào thì dung môi vẫn chảy đều đều ra khỏi cột và sẽ được dòng để rót lên trở lại cột.
- Sau khi nạp xong silicagel thì rót dung môi trở lại cột 1-3 lần để cột chặt chẽ. - Sau đó để ổn định cột khoảng 30 phút và khóa cột lại.
Bước 4: Nạp mẫu vào cột sắc ký
1. Mẫu hòa tan vào dung môi.
2. Mẫu cao hòa tan sệt ra bằng etanol.
3. Mở khóa cột để hạ mực dung môi xuống sát mực chất hấp phụ đang có trong cột.
4. Dung ống nhỏ giọt hút dung dịch mẫu cho vào đầu cột (đầu của ống nhỏ giọt sẽ dính xung quanh thành trong của cột)
5. Từ từ mở khóa cột để dung dịch mẫu thấm xuống bề mặt chất hấp phụ. Khi thấy mực dung dịch đã xuống sát mực chất hấp phụ thì khóa cột.
6. Khóa cột lại và nạp cho đến khi hết mẫu vào cột.
7. Mở khóa để hạ mực dung dịch mẫu xuống sát mặt thoáng chất hấp phụ. 8. Khóa lại lần nữa.
9. Dùng ống nhỏ giọt cho 1 lượng nhỏ 5-10 ml dung môi vào đầu cột khi dung môi này trong suốt, không có màu của mẫu thì hạ dung môi xuống sát mặt mẫu.
10. Cho 1 lớp bông đặt nhẹ trên mặt khóacủa chất hấp phụ.
42
pennicilin ở dưới và theo dõi, thử bản mỏng).
Chạy cột silica gel với hệ dung môi M/Cl/AA với tỷ lệ độ phân cực tăng dần từ 10:70:0,095 đến hệ M/Cl với tỷ lệ 10:60; 10:50; 10:40; 10:30; 10:20; 10:10, thu được 12 phân đoạn được ký hiệu từ F1 đến F12.
Trong đó, một số phân đoạn có vệt rõ, xuất hiện chất khi chạy thử trên sắc kí bản mỏng, đó là các phân đoạn F1, F4, F5, F6, F9 và F11. Dựa vào bản mỏng, ta thấy các phân đoạn F1 và F11 có nhiều vệt chất với Rf tương đối giống nhau nên được chọn để tiếp tục chạy sắc kí tiếp tục.