4. Nội dung nghiên cứu
2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
a. Thu nhận nguyên liệu
- Nguyên liệu lá cây Lim xanh được trồng tại xã Tiên Cảnh huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam như hình 2.1
- Lá Lim xanh được thu hái buổi sáng vào tháng 1 năm 2017. - Lá Lim xanh có tên khoa học : Erythrophleum fordii Oliver
- Lá Lim xanh thuộc họ thực vật Vang ( Caesalpinioideae), trong họ Đậu (Leguminosae), chi Erythrophleum, loài Erythrophleum fordii.
Hình 2.1. Lá cây Lim xanh được trồng tại xã Tiên Cảnh huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam.
b. Xử lý nguyên liệu
Lá Lim xanh sau khi được thu hái về, loại bỏ lá hư, tách lá ra khỏi cành, rửa sạch và đem phơi khô. Sau đó đem vào nghiền nhỏ, bảo quản trong lọ thủy tinh kín.
29
Hình 2.2. Lá Lim xanh mới thu hái về
Hình 2.3. Lá Lim xanh khô
30
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất a. Thiết bị và dụng cụ a. Thiết bị và dụng cụ
-Tủ sấy tại PTN B7 - trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
-Thiết bị cô quay chân không tại PTN B7 - trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng. - Bộ chiết Soxhlet tại PTN B4 - trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
-Máy đo sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (LC-MS) tại Trung tâm Nghiên cứu vật liệu cấu trúc Nano và phân tử (INOMAR)- Phường Linh Trung- quận Thủ Đức- Thành phố Hồ Chí Minh.
-Máy đo sắc ký lỏng cao áp kết hợp với mass (HPLC/MS) tại phòng thí nghiệm Sinh hoá hữu cơ (Prof. Kajihara’Laboratiory), Khoa Hoá, Đại học Osaka, Nhật Bản.
- Sắc ký bản mỏng TLC Sillica gel 60 F254 tại PTN B7 - trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
b. Hóa chất
Bảng 2.1. Danh mục các hóa chất chính được sử dụng.
TT Tên hóa chất Xuất xứ Đặc điểm
01 hexane C6H14
Trung Quốc
M = 86.16 g/mol; chất lỏng không màu; không tan trong nước; D = 0.6548 g/ml; t0
nc = -950C; t0s = 690C 02 Chloroform CHCl3 Trung Quốc
M = 119,38 g/mol; chất lỏng không màu; độ hòa tan trong nước 0,8g/100ml ở 200C;t0
nc =63,50C; t0 s = 61,20C. 03 butanol C4H10O Trung Quốc
M = 72.12 g/mol; chất lỏng không màu; t0nc = -89,80C; t0s = 117,70C
04 Ethyl acetate C4H8O2
Trung Quốc
M = 88.11 g/mol; chất lỏng không màu; độ hòa tan trong nước 8.3g/100ml ở 20oC; D = 0.8897 g/ml; t0
nc = -840C; t0
s = 770C. 05 Methanol
CH3OH Việt Nam
M = 32,04 g/mol; chất lỏng không màu; t0nc = -97,6oC; t0s = 64,7oC.
06 Ethanol
C2H5OH Việt Nam
M = 46,06844 g/mol; chất lỏng không màu; t0
nc = -114,1oC; t0
31
2.2. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
2.3. LỰA CHỌN PHÂN ĐOẠN CHIẾT TỐI ƯU 2.3.1. Phương pháp chiết 2.3.1. Phương pháp chiết
Cân chính xác lượng mẫu cần chiết Soxlet vào giấy lọc (5 g). Sau đó, cho vào bộ chiết Soxhlet gồm một bình cầu một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lưu. Dung môi ở trong bình cầu được làm bốc hơi từng phần, dung môi được ngưng tụ nhỏ vào chất được chiết đựng trong mốt cái túi bằng giấy lọc và sau đó lại chảy vào bình. Đặc biệt, dụng cụ chiết Soxhlet có thêm một ống xi-pông đặt ở bên cạnh chỉ để dung dịch chiết chảy vào bình khi nào mực nước chất lỏng trong ống chiết đạt được khuỷu trên của ống xi-pông. Chất được chiết cần có tỷ khối lớn hơn là dung môi. Trong quá trình đó cấu tử cần được tách làm giàu thêm trong dung môi.
32
Hình 2.5. Bộ chiết Soxhlet
2.3.2. Khảo sát dung môi chiết với dung môi Methanol
- Chuẩn bị 4 bộ Soxhlet ghi kí hiệu sẵn.
- Cân khoảng 5 g bột lá Lim xanh bó trong giấy lọc. - Cho vào mỗi bình cầu 150 ml methanol.
Tiến hành chiết với mỗi bộ ở 800C trong 3h đồng hồ.
Sau đó tiến hành chiết phân đoạn với mỗi dung môi khác nhau : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate. Lắc đều, đậy kín bằng nút thủy tinh trong vòng 2h. Sau thời gian trên tiến hành khử màu và ghi kí hiệu với mỗi loại dung môi.
33
Hình 2.6. Dịch chiết Lá Lim xanh với các dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate ( trước khi khử màu)
Hình 2.7 Dịch chiết Lá Lim xanh với các dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate (sau khi được khử màu)
Trong đó :
2004M1 là mẫu này được chiết vào ngày 20/04, chiết với dung môi methanol và chiết phân đoạn với hexane.
34
và chiết phân đoạn với chloroform.
2004M3 là mẫu này được chiết vào ngày 20/04, chiết với dung môi methanol và chiết phân đoạn với butanol.
2004M4 là mẫu này được chiết vào ngày 20/04, chiết với dung môi methanol và chiết phân đoạn với ethyl acetate.
Sau khi chiết phân đoạn với 4 loại dung môi, đem đi cô lại và cân khối lượng của mỗi phân đoạn.
hexane chloroform butanol ethyl acetate
Hình 2.8. Dịch chiết lá cây Lim xanh được cô lại ứng với các dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate.
2.3.3. Khảo sát dung môi chiết với dung môi Ethanol/nước
- Chuẩn bị 4 bộ Soxhlet ghi kí hiệu sẵn.
- Cân khoảng 5 g bột lá Lim xanh bó trong giấy lọc. - Cho vào mỗi bình cầu 200 ml ethanol/nước (95:5). Tiến hành chiết với mỗi bộ ở 800C trong 3h đồng hồ.
Sau đó tiến hành chiết phân đoạn với mỗi dung môi khác nhau : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate. Lắc đều, đậy kín bằng nút thủy tinh trong vòng 2h. Các phân đoạn chiết được cô lại hoặc được tiến hành khử màu, sau đó cô lại(cho các thí nghiệm tiếp theo). Cuối cùng, cân khối lượng của mỗi phân đoạn cao chiết.
35
Hình 2.9. Dịch chiết Lá Lim xanh với các dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate ( trước khi khử màu)
Trong đó:
DC1 là dịch chiết với dung môi hexane. DC2 là dịch chiết với dung môi chloroform. DC3 là dịch chiết với dung môi butanol . DC4 là dịch chiết với dung môi ethyl acetate.
Hình 2.10. Dịch chiết Lá Lim xanh với các dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate (sau khi được khử màu)
36
Trong đó :
2204E1 là mẫu này được chiết vào ngày 22/04/2017, chiết với dung môi ethanol/nước( 95:5,v/v) và chiết phân đoạn với hexane.
2204E2 là mẫu này được chiết vào ngày 22/04/2017, chiết với dung môi ethanol/nước( 95:5,v/v) và chiết phân đoạn với chloroform.
2204E3 là mẫu này được chiết vào ngày 22/04/2017, chiết với dung môi ethanol/nước( 95:5,v/v) và chiết phân đoạn với butanol.
2204E4 là mẫu này được chiết vào ngày 22/04/2017, chiết với dung môi ethanol/nước( 95:5,v/v) và chiết phân đoạn ethyl acetate.
Hình 2.11. Dịch chiết Lá cây Lim xanh được cô lại ứng với các dung môi
2.4. ĐỊNH TÍNH BẰNG CÁC THUỐC THỬ MÀU TƯƠNG ỨNG
Trong phân tích định tính đã sử dụng khá nhiều thuốc thử để xác nhận sự có mặt của alkaloids trong thực vật. Do cơ sở các phản ứng hóa học của alkaloids phần lớn không rõ ràng, nên người ta chỉ phân biệt các phản ứng này là phản ứng màu hoặc phản ứng tạo tủa.
Bột lá Lim xanh sau khi được chiết qua các dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate thử qua các loại thuốc thử : Mayer, Wanger, Dragendroff.
2.4.1. Thuốc thử Mayer
Chuẩn bị thuốc thử
Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất. Trộn hai dung dịch này vào nhau và thêm nước cất vừa đủ 100 ml.
Cách tiến hành
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào các phân đoạn chiết khác nhau, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt hoặc màu trắng.
2.4.2. Thuốc thử Dragendoff
37
- Dung dịch 1 : cho 0,5 g Bi(NO3)3 vào 10 ml nước cất. Thêm vào 10 ml HCl. Khuấy đều hỗn hợp.
- Dung dịch 2 : cho 4 g KI vào nước cho tan đều . Trộn hai dung dịch này vào nhau.
Cách tiến hành
Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendoff vào các phân đoạn chiết khác nhau, nếu có alkaloid sẽ chuyển từ màu cam đậm sang đỏ.
2.4.3. Thuốc thử Wanger
Chuẩn bị thuốc thử
Hòa tan 1,27 g Iod và 2 g KI trong 20 ml nước cất. Thêm nước cất vừa đủ 100ml.
Cách tiến hành
Nhỏ vài giọt thuốc thử Wangner vào các phân đoạn chiết khác nhau, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu.
2.5. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT
Các chủng vi khuẩn kiểm định được sử dụng trong thí nghiệm gồm Vi khuẩn Gram (-) : Pseudomonas aeruginosa, E.Coli, Klebsilla Vi khuẩn Gram (+) : Bacillus cereus
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy từ ống chủng gốc, trên môi trường LB đặt tại 370C, ủ qua đêm
Phương pháp thử hoạt tính ức chế khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al(2000)
Vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường nuôi cấy LB, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường nuôi cấy lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C. Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200 μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 x 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa Petri có chứa môi trường nuôi cấy đặc, để khô và đục 2-3 giếng, đường kính khoảng 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2-3 cm.
Chuẩn bị dịch chiết thử (dung môi) vào các giếng thạch trên đĩa Petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 300C trong 24 giờ. Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức:
38
BK = D – d Trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn
d là đường kính lỗ khoan thạch.
Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình.
Bố trí thí nghiệm : ảnh hưởng của dung môi đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn kiểm định
Chú thích : Số 1 ứng với lỗ thạch chứa nước cất, Số 2 ứng với lỗ thạch chứa dung môi
Bố trí thí nghiệm thử hoạt tính kháng sinh của dịch chiết trên các chủng vi khuẩn kiểm định
Chú thích : Số 1 ứng với nước cất, Số 2 ứng với dung môi, Số 3 ứng với dịch chiết
2.6. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CÁC DỊCH CHIẾT DỊCH CHIẾT
Việc định danh được các thành phần trong phân đoạn chiết của lá Lim xanh là cơ sở cho các hoạt động nghiên cứu tiếp theo về các nội dung khác có liên quan. Trong phạm vi đề tài này, tôi tiến hành xác định thành phần trong phân đoạn chiết của lá cây Lim xanh trong các dịch chiết của hexane, chlorofom, butanol và ethyl acetate.
Để xác định thành phần trong phân đoạn chiết của lá Lim xanh trong các loại dung môi khác nhau, cân lấy 10 g mẫu bột lá Lim xanh, sau đó tiến hành chiết
39
Soxhlet ở nhiệt độ sôi lần lượt với 500 ml của 04 loại dung môi (hexane, chlorofom, butanol và ethyl acetate) trong thời gian chiết là 2h. Dịch chiết thu được đem cô quay để đuổi bay đi một ít dung môi và tiếp tục tiến hành lọc dịch chiết bằng giấy lọc để loại bỏ cặn.
Sau khi có được phân đoạn chiết của lá Lim xanh của bốn dung môi khác nhau, tôi gửi mẫu đến tại Trung tâm Nghiên cứu vật liệu cấu trúc Nano và phân tử (INOMAR)- Phường Linh Trung- quận Thủ Đức- Thành phố Hồ Chí Minh.
2.7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC BƯỚC ĐẦU TRONG CÁC PHÂN ĐOẠN CHIẾT TƯƠNG ỨNG SINH HỌC BƯỚC ĐẦU TRONG CÁC PHÂN ĐOẠN CHIẾT TƯƠNG ỨNG
2.7.1. Phương pháp ESI-MS và phương pháp LC/MS
Phương pháp ESI-MS hay được gọi là quang phổ khối lượng ion hóa điện cực. Ứng dụng của phương pháp này cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide…hoặc các polymer công nghiệp như polyethylene glycol
Phương pháp LC/MS là phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ, gồm một hệ thống thiết bị tập hợp vừa có khả năng phân tách chất xuất sắc của sắc ký lỏng (LC) vừa có khả năng định lương xuất sắc của khối phổ (MS). Một phổ khối thu được bằng cách sử dụng chế độ quét sẽ cho biết trọng lượng phân tử và thông tin về cấu trúc, còn thời gian lưu được cung cấp bởi các đầu dò LC nhằm thực hiện phân tích định tính.
2.7.2. Phương pháp sắc kí bản mỏng
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử độ tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc.
Chuẩn bị dụng cụ
- Cốc thủy tinh có nút đậy kín.
- Đèn tử ngoại có bước sóng 254 nm. - Micropipet cỡ 1-20 ml.
- Bản mỏng đã cắt sẵn 1 x 5 cm.
- Hệ dung môi M:C:AA (Methanol : Cloroform : Acid Acetic) - Tủ sấy, các loại hóa chất đơn giản khác.
Cách tiến hành
40
cm làm vạch xuất phát. Dùng mao quản chấm các vết dung dịch thử lên.
- Đến khi vết khô thì cho vào các lọ đã chứa sẵn hệ dung môi, đặt bản mỏng thẳng đứng với bình và ở trên bề mặt dung môi, đậy kín.
- Khi dung môi đã khai triển trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra, đánh số thứ tự như hình 2.12.
- Chiếu vào hệ thống máy có đèn UV.
Hình 2.12. Các bản mỏng được đặt trong bình chứa các hệ dung môi tưng ứng
2.7.3. Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp. Sắc kí cột gồm sắc kí cột thường và sắc kí cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel. Đối với các chất có khối lượng phân tử khác nhau có thể sử dụng sắc kí cột Sephadex LH–20. Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp.
*Cách bước thực hiện
Bước 1 : Chuẩn bị cột sắc ký
1. Rửa sạch cột
2. Cho bông gòn vào (1mm) 3. Cho cát đã sấy vào (1mm) 4. Cho bông vào lớp trên tiếp.
41
Bước 2 : Chuẩn bị silicagel để nạp vào cột
1. Lấy cốc thủy tinh có mỏ cho dung môi giải ly vào cốc ( methanol:clorofom: acid acetic 10:70:0,095)
2. Cho silicagel ở dạng khô vào cốc từ từ từng ít một và khuấy đều. Đến khi cho hết silicagel vào cốc thì tiếp tục khuấy đều đến khi hỗn hợp đồng nhất và tương đối hết bọt khí
Bước 3 : Nạp silicagel vào cột sắc ký
1. Mở nhẹ khóa cột sắc ký để cho dung môi có sẵn trong cột chảy ra chầm chậm. Lấy 1 cốc có mỏ hứng dung môi chảy ra để ở bên dưới cột sắc ký
2. Rót chất hấp phụ (silicagel) dạng sệt vừa cân bằng ở trên vào đầu cột đến vị trí theo ý muốn (rót từng lượng ít một ).
- Vừa cho silicagel vừa lấy kẹp gỗ gõ nhẹ vào thành ngoài của cột. - Tiếp tục vừa rót silicagel vào cột vừa gõ nhẹ đến khi rót hết.
- Khi rót silicagel vào thì dung môi vẫn chảy đều đều ra khỏi cột và sẽ được dòng để rót lên trở lại cột.
- Sau khi nạp xong silicagel thì rót dung môi trở lại cột 1-3 lần để cột chặt chẽ. - Sau đó để ổn định cột khoảng 30 phút và khóa cột lại.
Bước 4: Nạp mẫu vào cột sắc ký
1. Mẫu hòa tan vào dung môi.
2. Mẫu cao hòa tan sệt ra bằng etanol.
3. Mở khóa cột để hạ mực dung môi xuống sát mực chất hấp phụ đang có trong cột.
4. Dung ống nhỏ giọt hút dung dịch mẫu cho vào đầu cột (đầu của ống nhỏ giọt sẽ dính xung quanh thành trong của cột)