4. Nội dung nghiên cứu
1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (LC-MS)
LC/MS là phương pháp được dùng trong phân tích vết (ppb, ppm) các hợp chất cần nhận danh chính xác. Trong những điều kiện vận hành nhất định ngoài thời gian lưu đặc trưng, các chất còn được nhận danh bằng khối phổ của nó [24].
a. Nguyên lý chung
Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hóa bằng các phương pháp thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm(-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn.
Tuy nhiên sự phát triển của kỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thường độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng lẻ.
Trong nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ, trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng.
24
giao diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB)…đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập niên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển ( Atmospheric Pressure Ionization- API)
Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous flow-fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray-TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm, không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: + Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).
+ Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization- APCI).
+ Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure photoionization – APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt ESI được sử dụng nhiều nhất[24].
b. Nguồn ion hóa trong đầu dò khối phổ
- Ion hóa tia điện (ESI)
ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kĩ thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide…hoặc các polymer công nghiệp như polyethylene glycol.
25
Hình 1.9. Hình ảnh sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
Được bắt nguồn từ hệ thống sắc ký lỏng, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn để từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển thành thế khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối.
Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào : dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch. Các dung môi phù hợp để phun sương là: methanol, acetonitrile, ethanol [24].
- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)
APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi.
Trong APCI, ion được hình thành như sau: mẫu hợp chất cần phân tích, hòa tan trong pha động, sau khi ra khỏi cột sắc ký, được cho đi ngang qua ống mao quản đốt nóng. Khi ra khỏi ống, nhờ khí N2, dung dịch được phun thành dạng sương từ đầu ra của nguồn APCI. Các giọt sương nhỏ được một dòng khí dẫn đến một ống thạch anh đun nóng, gọi là buồng dung môi hóa khí. Hợp chất đi theo luồng khí nóng ra khỏi ống để đến một vùng có áp suất khí quyển, nơi đây sẽ xảy ra sự ion
26
hóa hóa học nhờ vào que phóng điện corona, tại đây có sự trao đổi proton để biến thành ion dương (M + H)+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thành ion âm (M –H)-. Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bộ phân tích khối [24].
- Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI)
Thông thường, hợp chất phân tích thường ion hóa bằng nguồn ESI hoặc APCI, tuy nhiên, có một số chất không được ion hóa tốt bằng hai kỹ thuật này, ví dụ như polyaromatic hydrocarbons (PAHs), người ta sẽ sử dụng nguồn APPI. Kết hợp ưu điểm của giữa dòng khí phun thẳng góc với dòng ion, đèn krypton trong nguồn sẽ phát ra các photon có năng lượng cao đủ để ion hóa nhiều hợp chất hóa học khác nhau.
Ngoài ba nguồn ion hóa trên, còn có nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Mutimode ionization) có thể vận hành, thao tác ở hai chế độ ion hóa ESI và APCI [24].
c. Bộ phận của thiết bị LC/MS
Hệ thống phân tích khối phổ kế gồm có bộ phận đưa mẫu vào, bộ phận ghép nối giữa bộ phận tiêm mẫu và những bộ phận của hệ thống MS, nguồn ion hóa mẫu, các thấu kính tĩnh điện giúp tạo ion một cách hiệu quả, rồi khối phổ kế phân tách ion theo tỉ lệ m/z và các ion sau lọc sẽ đi vào đầu dò.
Căn cứ vào phương pháp phân tách ion thì có nhiều loại phổ kế khác nhau. Hình 1.10 là cấu tạo của hệ thống khối phổ có chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển kèm với sử dụng bộ phân tích khối tứ cực (còn gọi là bộ lọc khối tứ cực), hệ thống này thường được dùng như một đầu dò trong sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LC/MS. Một số kĩ thuật ion hóa ở áp suất khí quyển như ion hóa đầu phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) và chúng được dùng vừa như bộ phân ghép nối với HPLC và vừa như nguồn ion. Sau khi desolvat hóa, tại đây các ion tạo thành được điều hướng bởi bát cực để di chuyển bộ phân tích khối tứ cực. Trong bộ phân tích khối tứ cực, điện thế một chiều và xoay chiều RF được áp vào xen kẽ trên đường di chuyển của các ion và vì thế chỉ các ion đáp ứng đúng tỉ lệ m/z được lựa chọn trước mới có thể đi qua cho các cặp đối diện của các thanh này. Số lượng ion đi đến đầu dò sẽ được chuyển đổi thành tín hiệu và được ghi nhận bởi máy vi tính.
27
Hình 1.10. Cấu tạo hệ thống LC/MS
Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ:
Chế độ Scan
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Ví dụ : scan m/z 50-300 có nghĩa là quét tất cả các khối từ 50-300. Trong sắc ký khí, khi có thông tin về phổ MS(scan) thì có thể định tính bằng cách so với thư viện phổ để tìm ra chất tương ứng. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ scan thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.
Chế độ Sim ( Selected ion monitoring)
Trong chế độ Sim, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định. Sim chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Chế độ Sim có thể được dùng để định lượng. Ví dụ: trong khoảng khối từ 50-300 như trên, mảnh ion 150 là đặc trưng và cao nhất thì có thể chỉ chọn riêng m/z 150 ra để định lượng. Có thể chọn được nhiều ion một lần, và càng nhiều ion càng tốt về độ nhạy và độ chính xác. Đối với đầu dò khối phổ ba cực, chế độ sim thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
28
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU