Chiết là phương pháp dùng một dung môi thích hợp hòa tan chất cần tách thành một pha lỏng (gọi là dịch chiết) phân chia khỏi pha lỏng (hoặc pha rắn) chứa hỗn hợp các chất còn lại. Tách lấy dịch chiết, giải phóng dung môi sẽ thu được chất cần tách.
Người ta thường dùng phương pháp chiết để tách lấy hợp chất khi nó ở dạng nhũ tương hoặc huyền phù trong nước, hay để tách lấy chất hữu cơ ra khỏi một hỗn hợp ở thể rắn. Dung môi thường dùng là ete, benzen, clorofom, hexan,…
Ngoài phễu chiết thông thường, trong phòng thí nghiệm còn sử dụng các dụng cụ cho phép chiết liên tục bằng dung môi nóng nhằm tăng cường hiệu suất của việc chiết .
1.4. Phương pháp xác định thành phần các hợp chất trong tinh dầu và dịch chiết vỏ bưởi
1.4.1. Phương pháp sắc ký
Sắc ký là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào tướng
động được mang theo dọc hệ thống sắc kí có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp [15].
Quá trình thực hiện sắc ký gồm có 2 pha:
- Pha tĩnh: thường là ở dạng rắn hay lỏng, dưới dạng màng mỏng bám đều trên bề mặt của chất mang trơ chứa trong cột sắc ký.
- Pha động: gồm chất phân tích và dung môi thích hợp.
Quá trình sắc ký xảy ra trong cột chính là quá trình tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh trong cột. Quá trình tương tác đó có thể xảy ra theo các tính chất hóa lý nhất định: đó là sự hấp phụ, trao đổi ion, phân bố, rây phân tử. Tương ứng, ta có các tên gọi của phương pháp sắc ký: sắc ký hấp phụ; sắc ký trao đổi ion cùng dấu giữa chất phân tích với pha tĩnh; sắc ký phân bố. Hoặc dựa vào đặc điểm pha động người ta chia làm hai loại là sắc kí lỏng và sắc kí khí. Sự khác nhau về thời gian lưu của các chất phân tích trên pha tĩnh là cơ sở của phương pháp tách sắc kí [14],[15].
1.4.2. Phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC/MS: Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…
Sắc kí khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay dùng để tách, định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất hữu cơ.
Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải được hoá hơi để đưa vào cột sắc kí, thường hoá hơi dưới 2500C.
Pha tĩnh có thể là chất rắn được nhồi vào cột hay 1 màng film mỏng bám lên trên bề mặt chất mang trơ, hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong của thành cột (cột mao quản).
Tuỳ thuộc vào bản chất pha tĩnh chia thành hai loại sắc ký khí :
- Sắc ký khí rắn (gas solid chromatography – GSC): Chất phân tích được hấp phụ trực tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn.
- Sắc ký khí lỏng (gas liquid chromatography – GLC): Pha tĩnh là một chất lỏng không bay hơi.
Phương pháp này chỉ được giới hạn với chất có thể bốc hơi mà không bị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ xác định dưới thể hơi.
Có 2 loại kĩ thuật phân tích:
- Giữ cho nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình phân tích, phương pháp này khó tách hoàn toàn.
- Thay đổi nhiệt độ trong quá trình phân tích, phương pháp này tuy tốn thời gian nhưng triệt để.
Nguyên tắc hoạt động
Nhờ có khí mang trong chứa trong bom khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detectơ, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu được xử lí ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu
kết quả ( bộ hiện số, máy in hoặc máy ghi). Trên sắc đồ nhận được, sẽ có tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic. Thời gian lưu của pic là đại lượng đặc trưng cho chất cần phân tích. Diện tích pic là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.
Sắc đồ là tập hợp tất cả các pic, mỗi pic đại diện cho mỗi chất. Dựa vào thời gian lưu ta có thể xác định được tên chất và đo diện tích mỗi pic ta xác định được thành phần mỗi chất trong hỗn hợp.
1.4.4. Phương pháp khối phổ (MS)
Nguyên tắc của phương pháp khối phổ là dựa vào chất nghiên cứu được ion hoá trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không bằng những phương pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ion mảnh…) có số khối khác nhau, sau đó những ion này được phân tách thành những dãy ion theo cùng số khối m (chính xác là theo cùng tỷ số khối trên điện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi lại trên đồ thị có trục tung là xác suất có mặt (hay cường độ), trục hoành là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ.
Phổ khối lượng được ghi lại dưới dạng phổ vạch hay bảng, trong đó cường độ các vạch được đo bằng phần trăm so với đỉnh có cường đọ cao nhất. Đỉnh ion phân tử thường là đỉnh cao nhất, tương đương với khối lượng phân tử của hợp chất khảo sát.
Phổ khối lượng không những cho phép xác định chính xác phân tử lượng, mà căn cứ vào các mảnh phân tử tạo thành, ta cũng suy ra được cấu trúc phân tử. Xác suất tạo thành mảnh phụ thuộc vào cường độ liên kết trong phân tử cũng như vào khả năng bền hoá các mảnh tạo thành nhờ các hiệu ứng khác nhau. Các mảnh có độ bền lớn sẽ ưu tiên tạo thành, các liên kết yếu nhất dễ bị đứt nhất. Có những mảnh có khối lượng đặc trưng gọi là mảnh chìa khoá, chúng cho phép phân tích các phổ khối lượng dễ dàng.
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách tinh dầu từ vỏ quả bưởi từ vỏ quả bưởi
2.1.1. Nguyên liệu
Bưởi lấy từ Quảng Nam đem rửa sạch, gọt lấy vỏ xanh bên ngoài, để ráo rồi xay nhỏ, ngâm với nước muối trong thời gian 60 phút. Sau đó thực hiện quá trình chưng cất lôi cuốn hơi nước để tách lấy tinh dầu và dịch chiết.
Hình 2.1. Cây bưởi Quảng Nam Hình 2.2. Vỏ bưởi 2.1.2. Hóa chất
- Nước cất, dung dịch HCl chuẩn 0,1 N, NaCl, C2H5OH, phenolphtalein, KOH rắn.
- Và một số hóa chất thông dụng khác.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị chính
- Cốc có mỏ 500ml, 1 lít, bình tam giác, phễu, pipet, bình định mức. - Tủ sấy, bộ chưng cất tinh dầu,bếp đun cách thủy.
2.1.4. Quy trình tách chiết tinh dầu từ vỏ bưởi
Hình 2.3. Quy trình tách chiết tinh dầu từ vỏ bưởi
Khảo sát tính chất ăn mòn kim loại
Phân tích GC-MS Nước, NaCl Vỏ bưởi Xay Ngâm Chưng cất hơi H2O Ngưng tụ
Phân ly Nước chưng
Tinh dầu thô
Lắng Làm khan Na2SO4 Lắng, gạn Tinh dầu Khảo sát tính chất ăn mòn kim loại
Thuyết minh quy trình
Bước 1 : Vỏ bưởi tươi đem xay nhỏ, để ngâm trong dung dịch NaCl 3,5% khoảng 1 giờ.
Bước 2 : Sau đó tiến hành chưng cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trong thời gian 60 phút. Trong quá trình chưng cất, cần chú ý điều chỉnh nhiê ̣t đô ̣ di ̣ch ngưng sao cho nằm trong khoảng 100- 1200C (bằng cách điều chỉnh tốc đô ̣ nước làm la ̣nh) vì nếu di ̣ch ngưng quá nóng sẽ làm tăng đô ̣ hòa tan của tinh dầu vào nước và làm bay hơi tinh dầu. Để kiểm tra quá trình chưng cất kết thúc chưa, có thể dùng mô ̣t tấm kính hứ ng mô ̣t ít di ̣ch ngưng, nếu thấy trên tấm kính còn váng dầu thì quá trình chưng cất chưa kết thúc.
Bước 3 : Để nguội, lắng, phân ly tách lấy tinh dầu thô. Sau khi phân ly ta đươ ̣c tinh dầu thô và nước chưng. Làm khan tinh dầu bằng Na2SO4 khan, thu được tinh dầu tinh khiết.
Nguyên tắc của quá trình chưng cất lôi cuốn hơi nước là sự thẩm thấu, khuếch tán và hòa tan. Ban đầu nước từ bên ngoài thẩm thấu vào trong tế bào, sau đó xảy ra sự khuếch tán, hòa tan. Dưới tác dụng của nhiệt, hơi nước lôi cuốn tinh dầu bốc hơi, tiếp theo là sự
ngưng tụ ở bình hứng. Khi xay nhỏ nguyên liệu, các tế bào chứa tinh dầu bị vỡ, sự thẩm thấu và khuếch tán xảy ra nhanh hơn nên thời gian chưng cất ngắn hơn [12].
Lượng muối ăn thêm vào đóng vai trò là làm tăng tỉ trọng của nước, phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu - nước, làm cho tinh dầu dễ tách lớp trong quá trình chưng cất. Do đó, nó rút ngắn thời gian chưng cất.
Hình 2.4. Bộ dụng cụ chưng cất
Xử lý tinh dầu thô sau khi chưng cất: Vì tinh dầu ra khỏi bộ dụng cụ chưng cất là tinh dầu thô, còn chứa nhiều ta ̣p chất như: nước, mô ̣t số các hợp chất hữu cơ như chất màu, nhựa, sáp hòa tan. Để nâng cao chất lươ ̣ng tinh dầu và ta ̣o điều kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i trong quá trình bảo quản, nghiên cứu tinh dầu phải lắng, gạn, làm khan [7],[9].
2.1.5. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách tinh dầu
Tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của ba yếu tố sau: - Thời gian chưng cất.
- Nồng độ muối.
- Tỉ lệ nguyên liệu rắn/dung môi lỏng (nước): g/mL chính là tỉ lệ khối lượng g/g.
2.2. Xác định một số chỉ số hóa lý
2.2.1. Độ ẩm vỏ bưởi tươi
*Tiến hành: Chuẩn bị 5 chén sứ, rửa sạch, đánh số, sấy khô trong tủ sấy ở 600C . Đặt vào bình hút ẩm, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đem cân la ̣i đến khố i lượng không đổi m0. Mẫu để xác đi ̣nh đô ̣ ẩm là mẫu tươi và lấy ngẫu nhiên. Cân lượng mẫu chính xác 5 gam vỏ bưởi tươi xắt lát, cho vào chén sứ, cân lại trên cân phân tích được khối lượng m1 cho vào các chén sứ đã đươ ̣c chuẩn bị sẵn và được sấy ở nhiê ̣t đô ̣ trên. Cứ sau 2 giờ la ̣i lấy ra để trong bình hú t ẩm cho nguô ̣i đến nhiê ̣t đô ̣ phòng rồi cân (nếu cân khi còn nóng thì mẫu sẽ hút hơi nước của không khí), đến khi khối lươ ̣ng mẫu và cốc không đổi được khối lượng m2.
Độ ẩm của mỗi mẫu là hiê ̣u số giữa khối lượng mẫu trước và sau khi sấy.
W = m1- m2. W là lượng nước đã bay hơi. Hàm lượng % ẩm được tính theo công thức:
100 . (%) 1 2 m m m w (2.1)
Độ ẩm của mẫu là trung bình cộng của 3 mẫu. Trong đó: m1: Khối lượng chén sứ và nguyên liệu (g).
m: Khối lượng mẫu bưởi
m2: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g). W (%): Độ ẩm của mỗi mẫu.
2.2.2. Hàm lượng tro trong vỏ bưởi
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc nung đến khối lượng không đổi
- Cơ sở: Nguyên liệu có thể xem như hỗn hợp cơ học gồm chất hữu cơ (bị cháy sau khi nung) và một số hợp chất vô cơ bao gồm cặn rắn, một số hợp chất của kim loại không bị nung còn được gọi là tro.
m = m1 + m2
m: khối lượng của nguyên liệu (gam) m1: khối lượng của các chất hữu cơ (gam)
m2: khối lượng của các chất sau khi nung đến khối lượng không đổi (gam)
Hàm lượng tro (Ash) của nguyên liệu là tỉ số giữa khối lượng của các chất sau khi nung đến khối lượng không đổi (m2) trên khối lượng chung (m) của nguyên liệu, tính bằng %:
% 100 . 2 m m Ash (2.2)
- Tiến hành: Vỏ bưởi sau khi đã được sấy khô ở nhiệt độ 100 - 1030C, tiến hành cân một lượng chính xác khối lượng cần tro hóa. Nung ở nhiệt độ 8000C ± 250C, cho đến khi thu được được tro màu trắng ngà. Làm nguội trong bình hút ẩm. Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi giữa hai lần nung liên tiếp là 0,005 gam.
2.2.3. Hàm lượng kim loại có trong vỏ bưởi
Mẫu sau khi than hoá thì hòa tan bằng 5 ml axit nitric đặc. Sau đó thêm một ít nước cất vào, lắc kỹ và lọc để loại tạp chất. Sau đó cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước cất đến vạch, ta thu được dung dịch cần phân tích. Hàm lượng một số kim loại được xác định tại Trung tâm khí tượng thủy văn quốc gia – Khu vực Miền Trung , số 666 - Trưng Nữ Vương, Thành phố Đà Nẵng.
2.3. Xác định các chỉ số hóa học
2.3.1. Chỉ số axit
* Định nghĩa: Chỉ số axit được định nghĩa là số mg KOH cần dùng để trung hòa các axit tự do có trong 1g tinh dầu.
* Cách tiến hành: Cân 1g tinh dầu không lẫn nước, cho thêm 10mL etanol trung tính, nhỏ vài giọt phenolphtalein vào. Chuẩn độ bằng dung dịch KOH có nồng độ 0,089N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền vững.
Chỉ số axit được tính theo công thức: Ax = 56.C .VN
m
Trong đó: V: Số ml KOH 0,089 N đã dùng
m: Khối lượng tinh dầu đem trung hòa (g) CN: Nồng độ dung dịch KOH
Ax: Chỉ số axit
2.3.2. Chỉ số este
* Định nghĩa: Chỉ số este là số mg KOH xà phòng hoá hết lượng este có trong 1g tinh dầu.
* Cách tiến hành: Sử dụng mẫu đã xác định chỉ số axit ở trên, thêm chính xác 20mL dung dịch KOH 0,089N trong etanol. Lắp ống sinh hàn ngược vào bình và đun trong bếp cách thuỷ, đến khi phản ứng xà phòng kết thúc (khoảng 1 giờ, lúc đó dung dịch trong bình vẫn trong suốt và đồng đều, không biến đổi khi pha loãng với nước).Thí nghiệm được mô tả ở hình 2.3.
Cũng cùng một lúc song song với mẫu kiểm tra, làm một mẫu trống
tương tự với 20 mL KOH 0,089 N trong etanol và 10mL etanol, tiến hành trong cùng điều kiện như trên, sau khi phản ứng xảy ra xong, cho vào cả hai mẫu mỗi bình 5 giọt chỉ thị màu phenolphtalein 0,2% và chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N.
Hiệu số giữa số mL dung dịch HCl 0,01N đã dùng trong mẫu trắng và số mL đã dùng trong mẫu thử là số mL dung dịch KOH 0,01N đã dùng để xà phòng hoá các este có trong chất cần thử.
Chỉ số este tính bằng công thức: 2 1 S 56 ( ).0,1 E m V V
Trong đó m: Số gam tinh dầu.
V1: Thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng chuẩn độ mẫu thí nghiệm (ml).
V2 : Thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng chuẩn độ mẫu trắng (ml).
2.3.3. Chỉ số xà phòng hóa
* Định nghĩa: Chỉ số xà phòng hóa là số miligam KOH cần thiết để trung hòa các axit tự do và xà phòng hóa este chứa trong 1 gam tinh dầu.
Như vậy: Chỉ số xà phòng hoá bằng tổng chỉ số axit và chỉ số este.
2.3.4. Tỷ trọng của tinh dầu vỏ bưởi
*Định nghĩa: Tỷ khối của chất là tỷ lệ của khối lượng (m) đối với thể tích (V) của chất: d = (g/cm3)