PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU
PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng: Cây Đẳng sâm Bắc
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây Đẳng sâm Bắc
3.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu vô trùng Đẳng sâm Bắc
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Đẳng sâm Bắc
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ chồi Đẳng sâm Bắc
Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống cây Đẳng sâm Bắc giai đoạn sau in vitro
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu tạo vật liệu vô trùng
Phương pháp khử trùng mẫu cấy: Mẫu đoạn thân được rửa và loại bớt những bộ phận không cần thiết dưới vòi nước chảy. Sau đó mẫu được ngâm trong nước xà phòng loãng 5 phút. Tiếp tục rửa mẫu dưới vòi nước chảy sao cho sạch hết bụi bẩn và xà phòng. Tráng mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần trước khi đem vào tủ cấy để tiến hành khử trùng. Trong tủ cấy, mẫu được lắc với cồn 70% trong 2 phút, sau đó tráng nước cất vô trùng 3 lần. Mẫu sau đó được khử trùng bằng dung dịch Javen 60% với khoảng thời gian khác nhau: 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch Javen 60% đến khả năng tạo mẫu vô trùng
Công thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu, mỗi mẫu cấy vào 1 bình nuôi cấy.
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởngđến khả năng nhân nhanh chồi Đẳng sâm Bắc đến khả năng nhân nhanh chồi Đẳng sâm Bắc
Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Đẳng sâm Bắc
Cách tiến hành: Mẫu sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy khởi đầu sẽ cấy sang môi trường MS có bổ sung BAP với dãy nồng độ: 0,5; 1,0; 1,5; 2; 3 mg/l.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Đẳng sâm Bắc
Môi trường MS được bổ sung thêm kinetin theo dãy nồng độ: 0, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 mg/l; 0,5mg/l.
Thí nghiệm 4: Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc Kinetin kết hợp với nước dừa ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Đẳng sâm Bắc
Môi trường MS + nồng độ 1mg/l BAP thích hợp trong thí nghiệm 2 kết hợp nước dừa theo dãy nồng độ: 0, 10; 15; 20; 30; 40 ml/l.
Các thí nghiệm 2,3,4 được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi. Thời gian theo dõi qua mỗi lần cấy chuyển là 4 tuần.
Thí nghiệm 5, thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA) đến khả năng ra rễ Đẳng sâm Bắc
Các chồi Đẳng sâm Bắc đạt tiêu chuẩn được cấy chuyển sang môi trường 1/2MS có bổ sung các chất NAA và IBA với dãy nồng độ: 0; 0,2 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l; 1,0 mg/l.
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ ra rễ, số rễ, chất lượng rễ. Thời gian theo dõi sau 4 tuần. Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống cây Đẳng sâm Bắc giai đoạn sau in vitro
Bình Đẳng sâm Bắc sau khi ra rễ sẽ được đưa ra nhà lưới cảm ứng với điều kiện bên ngoài 10-15 ngày. Sau đó rửa sạch, để ráo nước và tiến hành cấy lên các loại giá thể: Đất (ĐC); Đất + cát (2:1); Đất + mùn cưa (2:1), Đất + trấu hun (2:1),
Đất + Xơ dừa (2:1).
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sống, biến động chiều cao. Thời gian theo dõi sau 30 ngày. Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần được nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.
* Điều kiện thí nghiệm:
Quá trình nuôi cấy (nuôi cấy khởi đầu, nhân chồi và tạo cây hoàn chỉnh) được tiến hành trong điều kiện nhân tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm duy trì như sau:
- Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng từ 2000- 25000 lux, thời gian chiếu sáng 8 - 10h/ngày.
- Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì 250C ± 20C.
- Độ ẩm thường xuyên duy trì 60 - 70%.
3.3.3. Phương pháp đánh giá
3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm thống kê sinh học Anova Phân tích phương sai 1 nhân tố trong Excel.