2.2.8. Nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của vật
liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro
Thí nghiệm nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. in vitro được tham khảo theo phương pháp của Nguyễn Thị Thu Thủy (2018) [55].
Vi khuẩn Xanthomonas sp. sau khi đưa về phòng thí nghiệm được bảo
quản ở 4°C. Trước các thí nghiệm, cấy truyền vi khuẩn trên đĩa petri chứa 15 – 20 mL môi trường LB Agar (25 g LB, 16 g agar, 1.000 mL nước, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút) để tạo khuẩn lạc đơn. Bước tiếp theo, cấy tăng sinh chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. bằng cách chuyển một phần khuẩn lạc đơn
của vi khuẩn vào bình tam giác 250 mL chứa 200 mL môi trường LB Broth (25 g LB, 1.000 mL nước, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút). Tiếp tục đưa bình tam giác chứa dịch vi khuẩn đem đi lắc tăng sinh ở 170 vòng/phút trong 24 giờ [71]. Dung dịch tăng sinh vi khuẩn được pha loãng đến 10-6 lần, hút 0,1 mL dung dịch vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng nhỏ lên đĩa petri chứa môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate với các nồng độ Cu là 15 ppm; 22,5 ppm; 30 ppm và thuốc thương mại Xantocin 40WP với nồng độ broponol 250 ppm, sử dụng que cấy thủy tinh trang đều lên bề mặt môi trường rồi tiến hành nuôi cấy ở cùng điều kiện (28°C).
Thí nghiệm gồm 05 nghiệm thức được lặp lại 03 lần, mỗi nghiệm thức lặp lại trên 03 đĩa petri. Các nghiệm thức gồm:
NT1: Môi trường LB Agar
NT2: Môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate 15 ppm Cu NT3: Môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate 22,5 ppm Cu NT4: Môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate 30 ppm Cu
NT5: Môi trường LB Agar bổ sung thuốc thương mại Xantocin 40WP 250 ppm broponol
Xác định mật độ vi khuẩn ở các nghiệm thức sau 24 giờ nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, hiệu lực ức chế (HLUC) vi khuẩn được xác định như sau:
HLUC (100%) = C − c
C × 100
Trong đó:
c: Mật độ khuẩn lạc ở nghiệm thức bổ sung chất thử
2.2.9. Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm nhà lưới nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm nhà lưới
Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong điều kiện nhà lưới được tham khảo từ nghiên cứu của Đoàn Thị Bích Ngọc và cộng sự (2020) [59].
Thời gian: từ 18/04/2020 đến 25/07/2020.
Địa điểm nghiên cứu: Khu nhà lưới Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam – Số 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh.
Giống lúa: Lúa nếp 46 (IR 4625).
Đất thịt được xử lý với vôi, sau đó cho vào các chậu nhựa với lượng đất bằng nhau, mỗi chậu gồm 7 kg đất thịt đã trộn với 4g phân bón NPK 16-16-8. Cấy 6 dảnh mạ giống lúa nếp IR 4625 trong các chậu nhựa có kích thước Ø 30×26,8 cm. Các chậu được đặt trong nhà lưới.
Phương pháp bón phân:
− Bón lần 1: Bón 3 g phân bón NPK 16-16-8 vào ngày thứ 10 sau cấy − Bón lần 2: Bón 3 g phân bón NPK 16-16-8 vào ngày thứ 20 sau cấy − Bón lần 3: Bón 3 g phân bón NPK 21-5-21 vào ngày thứ 5 trước khi trổ
bông.
Cây lúa sau 35 ngày tuổi thì bắt đầu phun 20 mL dung dịch nano Cu2O- Cu/alginate ở các nồng độ Cu là 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm và thuốc thương mại Xantocin 40WP (250 ppm broponol) theo nồng độ khuyến cáo. Nghiệm thức đối chứng âm phun nước lã. Sau 24 giờ phun thuốc, tiến hành lây nhiễm nhân tạo bằng cách tạo vết thương trên lá (cắt đầu lá) rồi phun dung dịch vi khuẩn
Xanthomonas sp. với mật độ 108 Cfu/mL, dung dịch vi khuẩn được phun ướt đều toàn bộ thân và lá cây lúa.
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm (a) và chuẩn bị thuốc thử (b)
Thí nghiệm gồm 05 nghiệm thức được lặp lại 03 lần, mỗi nghiệm thức lặp lại trên 03 chậu. Các nghiệm thức gồm:
NT1: Phun nước lã
NT2: Phun dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate (20 ppm Cu) NT3: Phun dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate (30 ppm Cu) NT4: Phun dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate (40 ppm Cu)
NT5: Phun thuốc thương mại Xantocin 40WP (250 ppm broponol)
Phương pháp điều tra bệnh hại: theo QCVN 01-166:2014/BNNPTNT [72]. Tiến hành thu thập số liệu tình trạng bệnh của cây lúa tại thời điểm sau 7 và 14 ngày lây nhiễm. Các chỉ tiêu theo dõi gồm:
- Tỷ lệ lúa nhiễm bệnh (TLB) được xác định theo công thức như sau:
TLB (%) = Số lá bị bệnh
Tổng số lá điều tra × 100
- Chỉ số lá bệnh (CSB) được xác định theo công thức Townsend- Heuberger:
CSB (%) = 9n9+7n7+ 5n5+3n3+ n1
9N × 100
Trong đó:
N: Tổng số lá điều tra
n1: Số lá bị bệnh ở cấp 1 có diện tích bệnh < 1% n3: Số lá bị bệnh ở cấp 3 có diện tích bệnh 1 – 5%
n5: Số lá bị bệnh ở cấp 5 có diện tích bệnh > 5 – 25% n7: Số lá bị bệnh ở cấp 7 có diện tích bệnh > 25 – 50% n9: Số lá bị bệnh ở cấp 9 có diện tích bệnh ≥ 50%
− Hiệu lực phòng trừ (HLPT) của thuốc được tính theo công thức Abbott:
HLPT (%) = (1 – Ta
Ca ) × 100 Trong đó :
Ta : Chỉ số bệnh ở nghiệm thức xử lý thuốc tại thời điều tra
Ca : Chỉ số bệnh ở nghiệm thức đối chứng âm tại thời điểm điều tra
Phương pháp đánh giá độc tính của thuốc đối với cây lúa (cấp độc): Theo thang phân 9 cấp độc tính như sau:
Bảng 2.1. Thang phân 9 cấp độc tính đối với cây trồng
Cấp độc Mức độ độc
1 Cây phát triển bình thường
2 Ngộ độc nhẹ, sinh trưởng của cây giảm nhẹ 3 Có triệu chứng ngộ độc nhẹ nhìn thấy bằng mắt.
4 Triệu chứng ngộ độc nhưng chưa ảnh hưởng đến năng suất. 5 Cành lá biến màu hoặc cháy, gây ảnh hưởng đến năng suất. 6 Thuốc làm giảm năng suất ít
7 Thuốc gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất 8 Triệu chứng ngộ độc tăng dần tới làm chết cây 9 Cây bị chết hoàn toàn
Phương pháp điều tra năng suất lúa:
Lúa sẽ được thu hoạch tại thời điểm 30 ngày sau khi trổ bông, tỷ lệ tăng năng suất ở các nghiệm thức có xử lý thuốc được tính theo công thức sau:
Năng suất tăng (%) = m − m0
m0 × 100
Trong đó:
m0: Năng suất lúa ở nghiệm thức chứng âm (g/chậu)
2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu
Kích thước hạt nano Cu2O-Cu/alginate được xác định bằng phần mềm Photoshop CS6 và được thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.
Tất cả các số liệu thử nghiệm in vitro và in vivo được xử lý thống kê và phân tích phương sai bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và phần mềm IRRISTAT 5.0 để so sánh sự sai khác có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình của các số liệu thực nghiệm. Số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE
Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học phức [Cu(NH3)4]SO4 hình thành từ CuSO4.5H2O và dung dịch NH3
theo phản ứng (3.1), hydrazin sử dụng làm chất khử và alginate làm chất ổn định, pH tối ưu cho phản ứng khử Cu2+ là pH > 11 [67].
Hình 3.1. Thay đổi màu sắc dung dịch trong quá trình khử Cu2+
Trong quá trình khử Cu2+ thành Cu+ và hình thành các hạt Cu2O-Cu có kích thước nano ổn định trong alginate, màu sắc dung dịch thay đổi từ màu xanh sang màu nâu đỏ đặc trưng của dung dịch keo nano. Phản ứng khử muối Cu2+ thành Cu2O được mô tả theo phương trình phản ứng sau [30]:
Cu2+ + 4NH4OH → [Cu(NH3)4]2+ + 4H2O (3.1) 4[Cu(NH3)4]2+ + N2H4 + 16OH- + alginate → 2Cu2O/alginate + N2 +
16NH3 + 6H2O + 8OH- (3.2)
2Cu2O/alginate + N2H4 → 4Cu°/alginate + N2 + 2H2O (3.3) Cu2O/alginate + Cu°/alginate → Cu2O-Cu/alginate (3.4)
3.1.1. Kết quả xác định kích thước và sự phân bố kích thước hạt của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate
Hình thái và sự phân bố kích thước của các hạt nano Cu2O-Cu ổn định trong alginate được thể hiện trong ảnh TEM hình 3.2. Hạt nano có hình cầu, với độ phân tách tốt và phân bố trong phạm vi hẹp từ 2 – 10 nm, kích thước hạt
trung bình là 5,3 ± 2,5 nm. Hàm lượng Cu trong vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được xác định bằng phương pháp ICP-MS là 5,087 mg/L. Kết quả này cho thấy alginate là chất ổn định thích hợp để tổng hợp hạt nano Cu2O-Cu với kích thước nhỏ khoảng 5 nm và nồng độ Cu cao tới 5.000 ppm.
Hàm lượng Cu của vật liệu nano được tổng hợp trong luận văn này cao hơn gấp hàng trăm lần so với các nghiên cứu của các tác giả trước đây: Yang và cộng sự (2015) điều chế nano Cu2O@Cu ổn định trong PVP với nồng độ Cu từ 0,13 – 0,20 mM thu được các hạt nano Cu2O có kích thước khoảng 55 nm, các hạt nano Cu2O@Cu có lõi giả định là 55 nm, vỏ Cu từ 15 – 30 nm [73]. Nhóm tác giả Giannousi và cộng sự (2014) tổng hợp được dung dịch keo Cu có nồng độ 0,15 mM với kích thước hạt Cu2O khoảng 30 nm, hạt Cu/CuO khoảng 7 nm, hạt Cu/Cu2O khoảng 170 nm [30]. Vì vậy, việc nghiên cứu điều chế vật liệu nano composite Cu2O-Cu/alginate với nồng độ cao trong khảo sát của luận văn này không những có ý nghĩa khoa học mà còn có tiềm năng ứng dụng vật liệu trong đời sống.
Hình 3.2. Ảnh chụp TEM (a) và sự phân bố kích thước hạt nano Cu2O- Cu/alginate (b)
3.1.2. Nghiên cứu cấu trúc tinh thể của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate Cu/alginate
Giản đồ XRD của alginate chiết suất từ rong nâu và nano Cu2O- Cu/alginate được thể hiện trong hình 3.3.
Hình 3.3. Giản đồ XRD của alginate (a) và nano Cu2O-Cu/alginate (b)
Giản đồ XRD của alginate ở hình 3.3a cho thấy, alginate được chiết xuất từ rong nâu Khánh Hòa xuất hiện 2 đỉnh đặc trưng của alginate ở 2θ ~13,4° và 21.6°, ngoài ra còn xuất hiệu các đỉnh ở mức 2θ ~28,2°; 29,3°; 31,9°; 32,4° và 34,2°, chứng tỏ rằng alginate có cấu trúc tinh thể. Những vị trí nhiễu xạ khác có thể alginate chiết xuất từ rong biển còn chứa một số khoáng chất và hợp chất hữu cơ có trong rong biển. Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được nghiên cứu sử dụng trong nông nghiệp nên không cần thiết phải tinh sạch alginate bởi vì các khoáng chất và hợp chất hữu cơ như axit amin, protein là chất dinh dưỡng cho cây trồng.
Giản đồ XRD của nano Cu2O-Cu/alginate ở hình 3.3b thể hiện các đỉnh đặc trưng của Cu2O và Cu, chứng tỏ các ion Cu2+ đã bị khử thành Cu° và Cu+. Sáu đỉnh ở vị trí 2θ ~29,6°; 36,4°; 42,4°; 61,5°; 73,6°; 77,5° tương ứng với các mặt phẳng (110), (111), (200), (220), (311) và (222) của dữ liệu tiêu chuẩn cho cấu trúc tinh thể lập phương tâm mặt của Cu2O. Đồng thời trong giản đồ XRD hình 3.3b cũng cho thấy các đỉnh đặc trưng của Cu° ở các vị trí có góc 2θ ~43,4° (111); 50,6° (200); 74,3° (220), các các đỉnh này cho thấy kim loại Cu có cấu trúc tinh thể lập phương. Các đỉnh này phù hợp với các đỉnh được đưa ra bởi dữ liệu JCPDS phổ XRD cho Cu2O (JCPDS: 34-1354) và Cu° (JCPDS: 04- 0836) và phù hợp với các nghiên cứu về Cu2O của Badawy và cộng sự (2015) [74].
Kích thước hạt Cu2O và Cu trong vật liệu Cu2O-Cu/alginate được xác định bằng phương trình Scherrer [35] từ giản đồ XRD (hình 3.3b) lần lượt ở vị
trí 2θ ~36,3° và 2θ ~43,5° là 5,6 và 6,3 nm trình bày trong bảng 3.1. Kích thước hạt nano Cu2O-Cu tính theo phương trình này lớn hơn kích thước hạt trung bình của chúng khi đo bằng phương pháp đo TEM. Có thể các hạt Cu2O-Cu đã bị kết tụ khi chúng ở dạng bột trong quá trình đo XRD [75].
Bảng 3.1. Kích thước hạt nano Cu2O và Cu tính qua phổ XRD
Hạt 2θ (°) FWHM (°) Kích thước (nm)
Cu2O 36,4 1,479 5,6
Cu 43,4 1,336 6,3
3.1.3. Phổ FT-IR của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate
Dữ liệu phổ hồng ngoại của alginate và nano Cu2O-Cu/alginate được biểu diễn trong hình 3.4.
Hình 3.4. Phổ FT-IR của alginate chiết xuất rong nâu (a) và nano Cu2O- Cu/alginate (b)
Phổ FT-IR hình 3.4a cho thấy sự hiện diện của axit mannuronic, các liên kết hydro (O–H) và (C–H) ở vị trí số sóng lần lượt là 830 cm-1, 3468 cm-1 và 2928 cm-1 tương ứng trong alginate. Hai đỉnh hấp thụ mạnh được quan sát thấy ở vị trí số sóng 1.610 cm-1
và 1.415 cm-1 được cho là dao động không đối xứng và đối xứng của các nhóm carboxylate (O–C–O) tương tự như nghiên cứu của tác giả Khajouei và cộng sự (2018) [76]. Đỉnh hấp thụ ở vị trí số sóng 1.128
cm-1 là đặc trưng của dao động C-O kéo dài trong vòng pyranose của alginate. Phổ FT-IR hình 3.4b cho thấy sự thay đổi từ vị trí số sóng 3.459 đến 3.428 cm-
1
đó là do alginate ổn định các hạt nano Cu2O-Cu. Sự giảm tần số này có thể xảy ra do sự tương tác phối trí của Cu° với các nhóm –OH [77]. Mặt khác, dải liên kết tập trung ở số sóng 618 cm-1 đặc trưng cho Cu2O và được gán cho dao động của Cu-O trong phân tử Cu2O [28]. Khi xảy ra sự ổn định, xuất hiện dải tương ứng với dao động của –C–O–ở vị trí số sóng thấp hơn từ 1.128 đến 1.111 cm-1 [77]. Từ dữ liệu phổ FI-IR nêu trên đã xác nhận sự hình thành của nano Cu2O-Cu trong dung dịch keo. Như vậy các hạt nano Cu2O-Cu được ổn định trong alginate có thể là do liên kết phối trí giữa Cu° với nhóm C=O, O–C–O và –OH của alginate như nghiên cứu của Visurraga và cộng sự (2012) trong nghiên cứu điều chế nano Cu bảo vệ bằng alginate [77].
3.1.4. Phổ UV-vis của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate
Phổ UV-vis của phức hợp alginate/Cu2+ và nano Cu2O-Cu/alginate được biểu diễn trong hình 3.5.
Hình 3.5. Phổ UV-vis của alginate/phức Cu2+ (a) và nano Cu2O-Cu/alginate (b)
Hình 3.5a cho thấy, xuất hiện một đỉnh hấp thụ của alginate/Cu2+ ở bước sóng 234 nm đặc trưng cho alginate. Theo các nghiên cứu trước đây, dải hấp thụ cực đại đặc trưng cho các hạt nano Cu nằm trong phạm vi từ 550 – 600 nm và của các hạt nano Cu2O nằm trong phạm vi từ 300 – 500 nm [78]. Phổ UV- vis của mẫu nano Cu2O-Cu/alginate được trình bày trong hình 3.5b cho thấy
chỉ xuất hiện đỉnh hấp thụ đặc trưng của các hạt nano Cu trong dung dịch ở khoảng bước sóng từ 605 – 610 nm, không quan sát thấy đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho Cu2O nằm trong khoảng bước sóng từ 300 – 500 nm. Theo tác giả Yang và cộng sự (2015), hiện tượng này có thể giải thích như sau: Các hạt nano Cu2O bao bọc bên ngoài bị chất khử tiếp tục khử Cu+ thành Cu° hình thành cấu trúc vỏ Cu và lõi Cu2O (Cu@Cu2O core-shell) [73].
Giản đồ XRD của mẫu Cu2O-Cu/alginate (hình 3.3) cho thấy chúng gồm 2 thành phần là Cu2O và Cu do có các đỉnh đặc trưng của 2 nguyên tố này. Dựa trên kết quả nhiễu xạ tia X và phổ UV-vis có thể kết luận, do dư chất khử N2H4, ion Cu+ bị khử thành Cu° theo phương trình 3.4 [73].
Khi lớp vỏ Cu2O bị khử thành Cu° sẽ tạo thành các hạt nano có lớp vỏ Cu° và lõi là Cu2O, cơ chế tạo cấu trúc lõi-vỏ được mô tả ở hình sau:
Hình 3.6. Sơ đồ mô phỏng mô phỏng phản ứng tạo cấu trúc nano lõi-vỏ Cu2O@Cu [73]
Điểm mới và khác biệt của quá trình tổng hợp hạt nano Cu2O@Cu của luận văn này so với phương pháp của Yang là quá trình khử Cu2+ với chất khử N2H4 chỉ cần một giai đoạn. Quy trình của Yang sử dụng chất khử axit ascorbic