2.2.1. Chọn bệnh nhân
a. Đối với nhĩm mới nhiễm chưa điều trị:
Bệnh nhân cĩ kết quả xét nghiệm phát hiện HIV dương tính sau khi qua tham vấn, nếu hội đủ các tiêu chuẩn chọn mẫu và đồng ý tham gia chương trình sẽ thực hiện cam kết tham gia và được bác sĩ thăm khám lâm sàng, thu thập các thơng tin theo phiếu câu hỏi về thơng tin cá nhân, tiền sử bệnh lý, các yếu tố lây nhiễm... (xem phần phụ lục 2 trang 112 và phụ lục 3 trang 115) và lấy máu tiến hành xét nghiệm đếm số lượng tế bào TCD4. Những bệnh nhân cĩ số TCD4 ≥ 500 tế bào/mm3 sẽ được thực hiện xét nghiệm đo nồng độ virút tự do trong máu và kháng thuốc ARV.
b. Đối với nhĩm thất bại điều trị:
Những bệnh nhân đang điều trị tại các phịng khám ngoại trú ở Tp. HCM, được đánh giá thất bại điều trị theo các chỉ tiêu của Tổ chức Y tế Thế giới, nếu đồng ý tham gia chương trình nghiên cứu sẽ được ký cam kết và lấy máu cho xét nghiệm đo nồng độ virút và HIV kháng thuốc.
- Số lượng tế bào TCD4.
- Nồng độ virút huyết tương.
- Tỷ lệ HIV kháng thuốc ở mức độ kiểu gen, các đột biến kháng và tình trạng kháng thuốc ARV.
2.2.3. Quy trình thực hiện:
Lấy mẫu: Mỗi bệnh nhân được lấy 5-6ml máu tồn phần chống đơng bằng EDTA 10%.
+ 1ml để thực hiện cơng thức máu và đếm số lượng tế bào TCD4 (chỉ dành cho nhĩm bệnh nhân mới nhiễm chưa điều trị).
+ 5ml dùng cho nghiên cứu kháng thuốc ARV: trong khoảng thời gian từ 4-6 giờ sau khi lấy mẫu, máu được quay ly tâm 1.200 vịng/phút trong 5 phút và tách lấy huyết tương, chia nhỏ vào nhiều ống khác nhau, mỗi ống 0,5 mL và bảo quản ở -800C cho đến lúc tiến hành xét nghiệm.
Các kỹ thuật sử dụng:
Cơng thức máu: Máy huyết học tự động Cell-Dyn 3200.
Đếm số lượng tế bào TCD4/ TCD8: dùng các kháng thể đơn dịng anti CD45, CD3, CD4, CD8 đánh dấu huỳnh quang (BD science) và phân tích trên máy FACS Calibur.
Đo nồng độ virút tự do trong máu – HIV- RNA real time PCR:
RNA được tách chiết bằng kit QIAamp@ Viral RNA Minikit - Qiagen. Sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR với kit Generique Charge Viral – Biocentric để xác định nồng độ HIV RNA tự do trong máu tại thời điểm thực hiện xét nghiệm kháng thuốc.
Những bệnh phẩm cĩ nồng độ HIV-RNA ≥1000 bản sao/mL (tương đuơng
3logbảnsao/mL) được khuếch đại và giải trình tự trên vùng gen RT (reverse
transcriptase – 804bp) và Prot (protease – 515bp) (theo quy trình của ANRS – Pháp). Đây là 2 gen liên quan đến đích tác động của thuốc ARV trong chu trình nhân lên của HIV. Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm
CEQTM8000 – Beckman Coulter, so sánh với trình tự tham chiếu là chủng HBX2 nhạy với thuốc ARV. Trình tự nucleotide của mẫu sau khi phân tích sẽ được so sánh với ngân hàng dữ liệu quốc tế về HIV kháng thuốc – Stanford (Hoa Kỳ) để xác định đặc điểm kháng thuốc. Các đột biến được ghi nhận khi sự thay đổi nucleotide xảy ra đồng thời trên cả 2 mạch xuơi, ngược và dẫn đến sự thay đổi axit amin. Đột biến cĩ thể là sự thay đổi 1 nucleotide, sự tồn tại đồng thời nhiều nucleotide tại cùng 1 vị trí, sự mất hay chèn thêm một hay nhiều bộ ba mã hĩa.
Phân tích số liệu:
Số liệu được nhập và làm sạch bằng phần mềm Epidata 3.0, sau đĩ được phân tích trên phần mềm STATA 10.0.
Xử lý số liệu:
Tần suất hiện nhiễm tại một thời điểm và khoảng tin cậy 95% được sử dụng để ước tính tần suất của sự xuất hiện kháng thuốc ARV, loại đột biến ở nhĩm bệnh nhân thất bại điều trị ARV.
Phân phối tần suất và tỷ lệ phần trăm được dùng để mơ tả các biến định tính; trung bình, trung vị, và phương sai để ước tính cho các biến định lượng.
Các kiểm định thống kê như Chi-square, Fisher exact và phân tích hồi qui tương quan đa biến dùng để xác định các yếu tố liên quan đến tình trạng xuất hiện kháng thuốc.
TĨM TẮT PHÁC ĐỒ NGHIÊN CỨU Tìm hiểu tính kháng thuốc ARV
Nhĩm bệnh nhân mới nhiễm chưa điều trị ARV
≤25 tuổi / mới nhiễm <6 tháng,
(tải lượng virus ≥ 3logbản sao/mL)
Đánh giá tỷ lệ thất bại về mặt virus học Tìm đột biến KT kiểu gen
CD4 ≥ 500 tb/mm3, chưa dùng ARV
Nhĩm bệnh nhân thất bại điều trị
thất bại miễn dịch và / hoặc lâm sàng (theo tiêu chuẩn của WHO)
Đánh giá mức độ lan truyền HIVKT - Xác định các yếu tố liên quan đến tình trạng KT - Xác định % xuất hiện HIVKT - Xác định đặc điểm KT (đột biến KT, tình trạng KT) NRTI / N NRTI / PI Tìm các đột biến KT đối với từng nhĩm thuốc Tính tỷ lệ xuất hiện đột biến
Suy ra mức độ lan truyền chủng HIVKT trong cộng đồng (Dựa trên phân loại của WHO
Tình trạng kháng với từng loại thuốc thuộc nhĩm NRTI / N NRTI / PI Tìm hiểu các yếu tố liên quan đến tình trạng KT NRTI / N NRTI / PI % xuất hiện từng đột biến KT thuộc nhĩm (Phân tích đơn biến, đa biến)
Nhĩm mức độ lan truyền cao: tỷ lệ % đột biến KT tự nhiên trong cộng đồng > 15%
(*): Nhĩm mức độ lan truyền thấp: tỷ lệ % đột biến KT tự nhiên trong cộng đồng <5%
TĨM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1 ml máu (EDTA) Đếm số lượng tế bào CD4 (BN mới nhiễm chưa iđ ều trị ARV) Huyết tương (lưu -70OC)
Tách chiết RNA (kit Qiagen) 5 ml máu (EDTA)
Định lượng HIV RNA (kit Generic Charge Viral – Biocentric)
•So sánh với ngân hàng dữ liệu
•(ANRS & Stanford) RT-PCR (gen Prot & RT)
Giải trình tự (gen Prot & RT)
•Phân tích số liệu
•(Epi-info & Stata) HIV RNA < 3logbản sao/mL
Khơng thực hiện xét nghiệm kháng thuốc HIV RNA ≥ 3logbản sao/mL
Chương 3
3.1. Tìm hiểu mức độ lan truyền chủng HIV kháng thuốc trong cộng đồng
Mức độ lan truyền các chủng HIV kháng thuốc trong cộng đồng được đánh giá trên nhĩm bệnh nhân mới nhiễm chưa từng điều trị với ARV.