Những chủng HIV-1 kháng thuốc ARV thường được xác định thơng qua thử nghiệm in vitro, bổ sung thuốc ARV trong mơi trường nuơi cấy. Những chủng HIV-1 phân lập được trên mơi trường cĩ nồng độ thuốc ARV cao sẽ được giải trình tự gen để xác định những thay đổi di truyền dẫn đến tính kháng thuốc. Trong một số trường hợp, những đột biến chuyên biệt sẽ được tạo nhân tạo đơn lẻ trên chủng nhạy để khẳng định vai trị liên quan đến tính kháng thuốc của đột biến đĩ.
1.13.1. Thử nghiệm kiểu hình:
hiện ở một vài phịng thí nghiệm trên thế giới. Các chủng virút được nuơi cấy trong mơi trường cĩ bổ sung các thuốc ARV. Kết quả được xác định bằng tỷ lệ CI 50 hoặc CI 90 (nồng độ ức chế 50% hoặc 90%) của chủng virút cần nghiên cứu so với chủng reference nhạy cảm với thuốc.
Thử nghiệm ở mức độ kiểu hình phụ thuộc rất nhiều các thơng số như số lượng virút dùng trong thử nghiệm, loại tế bào dùng làm tế bào chủ cho virút nhân lên và cách thức đánh giá sự nhân lên của virút.
Thử nghiệm kiểu hình chủ yếu dùng trong nghiên cứu và xác định lại các đột biến gien kháng ARV.
1.13.2. Các phương pháp xác định tính kháng thuốc ARV kiểu gen
Các phương pháp xác định tính kháng thuốc ở mức độ kiểu gen nhằm mục đích xác định những thay đổi trong bộ gen của HIV-1 gây tính kháng. Một số các phương pháp xác định tính kháng thuốc ARV của HIV-1 ở mức độ kiểu gen như:
Phương pháp giải trình tự DNA
- Phản ứng PCR sequencing (cycle sequencing).
- Giải trình tự dựa vào phản ứng lai với các mẫu dị oliogo (Gene chip sequencing).
Phương pháp phát hiện đột biến điểm
- Kỹ thuật PCR phát hiện đột biến với mồi chuyên biệt.
- Kỹ thuật lai phân biệt (Differential hybridization).
- Kỹ thuật Real time PCR.
a. Phương pháp giải trình tự DNA: sử dụng các kỹ thuật sau + Phản ứng PCR sequencing (cycle sequencing):
qua việc sử dụng các dideoxynucleotit của Sanger: dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase trong đĩ sử dụng thêm các dideoxynucleotit cĩ nhĩm 3’OH được thay bằng H và được đánh dấu bằng các fluochrom cùng với các deoxynucleotit thơng thường. Các dideoxynucleotit này khơng cịn khả năng hình thành các nối phosphodieste và do đĩ sẽ làm ngưng quá trình tổng hợp, kết quả là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA cĩ kích thước khác nhau. Mỗi loại dideoxynucleotit được đánh dấu bằng một flouchrom cĩ màu khác nhau. Như vậy tất cả các oligonucleotit cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotit sẽ cĩ cùng một màu. Các phân đoạn DNA sẽ được điện di trên gel polyacrylamid cĩ khả năng phân tách 2 trình tự DNA chỉ chênh nhau một nucleotit, sau khi điện di, kết quả sẽ được đọc qua hệ thống máy vi tính.
+ Gene chip sequencing: Kỹ thuật gene chips giải trình tự nucleotide bằng cách lai DNA mục tiêu với thư viện các mẫu dị oligonucleotide (với các trình tự khác nhau) được gắn trên miếng chip silica nhỏ.
Kỹ thuật gene chips là kỹ thuật kết hợp 2 cơng nghệ: Cơng nghệ quang hĩa học giúp tổng hợp hàng trăm hàng ngàn các oligonucleotides với độ chính xác cao. Và cơng nghệ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang cho phép đo sự tương tác phân tử trên các vị trí của miếng chip. Số lượng mẫu dị trên 1 miếng chip 1.28cm2 là 409,000 oligodeoxynucleotides.
Phương pháp giải trình tự nucleotide cĩ ưu điểm cung cấp đầy đủ thơng tin về các trình tự nucleotide của vùng gen quan tâm và cho phép đánh giá khả năng liên quan tính kháng thuốc ARV bằng so sánh kết quả giải trình tự nucleotide của chủng HIV khảo sát với trình tự nucleotide consensus (đại diện cho chủng nhạy). Tuy nhiên phương pháp này địi hỏi kỹ thuật viên cĩ kinh nghiệm.
b. Phương pháp phát hiện đột biến điểm: sử dụng các kỹ thuật sau
+ Kỹ thuật PCR phát hiện đột biến điểm với mồi chuyên biệt: Người ta thiết kế những mồi chuyên biệt mang tính đặc hiệu cao ở đầu 3’ với chủng hoang dại hoăc chủng đột biến. DNA đích chỉ được khuếch đại khi đầu 3’ của mồi được bắt cặp bổ sung hồn hảo. Người ta ứng dụng kỹ thuật này trong việc kiểm tra số lượng mẫu lớn từ những bệnh nhân đang điều trị, giám sát sự tồn tại của các đột biến chính (đã biết) trên những chủng HIV-1 phân lập từ bệnh nhân biểu hiện sự thất bại trong điều trị. Tuy nhiên kỹ thuật này khĩ áp dụng thực tế vì cĩ rất nhiều vị trí đột biến cĩ ý nghĩa kháng thuốc trong cả bộ gen của HIV-1.
+ Kỹ thuật lai phân biệt: Kỹ thuật này dựa trên kỹ thuật PCR kết hợp ELISA, trong phản ứng PCR khuếch đại sử dụng 1 mồi biotinyl hĩa và sản phẩm PCR sẽ cĩ 1 đầu được biotinyl hĩa. Sau đĩ sản phẩm PCR sẽ được gắn lên bề mặt giếng của microtiter plate, và đem lai với mẫu dị oligonucleotide (gắn đặc hiệu với chủng hoang dại hoặc chủng mang những đột biến đã biết) cĩ một đầu được gắn enzyme hĩa học (alkaline phosphatase). Xác định tỉ lệ của chủng hoang dại và đột biến nhờ vào đo mật độ quang (OD) của phản ứng màu hĩa học khi cho cơ chất phù hợp. Kỹ thuật này cĩ thể tiến hành với số lượng mẫu nhiều và độ nhạy cao cĩ thể khuếch đại được những quần thể chiếm tỉ thấp trong cơ thể của bệnh nhân. Tuy nhiên kỹ thuật này lại cĩ nhược điểm là số lượng đột biến cĩ thể phát hiện bị hạn chế.
* Các sinh phẩm thương mại hĩa trong xác định tính kháng thuốc ARV ở mức độ kiểu gen của HIV-1(Genotyping assays):
+ Sinh phẩm Gene Chip Sequencing Assays (Affymetrix) + Sinh phẩm Line Probe Assays (LiPA) (Murex, Innogenetics) + Truegene system (Visible genetic)
+ HIV ViroSeq (Abbotte).