cs, 2019)
Phương pháp nghiên cứu được tiến hành theo Jothi và cs (2019), khi xác định một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp levan. Theo đó, chủng B. subtilis sẽ được hoạt hóa trên môi trường L1 qua đêm, sau đó nhân giống trên môi trường L2 nuôi ở 370C trong vòng 48 giờ và lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Sau khi hoạt hóa, vi khuẩn được cấp vào bình 250 ml chứa 50 ml môi trường sinh tổng hợp levan với các thông số nghiên cứu dưới đây:
2.4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose
Vi khuẩn sẽ được cấp vào môi trường có chứa lần lượt 20, 40, 60, 80, 100 g/l đường sucrose. Chủng được nuôi lắc 150 vòng/phút, ở 370C, pH 7 trong 24 giờ, nồng độ nito cấp 1,5g/l và tính hàm lượng levan thu được ở mỗi nồng độ sucrose trên.
2.4.1.2. Ảnh hưởng của pH
Tiến hành nuôi cấy B. subtilis trên môi trường sinh tổng hợp levan có chứa nguồn sucrose với nồng độ thích hợp như đã xác định ở pH ban đầu thay đổi như sau:
4, 5, 6, 7 và 8 trên máy lắc 150 vòng/phút ở 37oC trong 24 giờ, nồng độ cấp nito 1,5g/l; môi trường YE. Xác định hàm lượng levan ở các nồng độ pH trong thí nghiệm
2.4.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nito
Nuôi vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp levan có bổ sung nguồn sucrose và điều chỉnh pH thích hợp. Các môi trường được thử nghiệm có chứa YE (cao nấm men), BE (cao thịt bò), ME (cao thịt lợn). Các thông số khác được giữ ở: tốc độ lắc 150 vòng/phút ở 370C trong 24 giờ nồng độ nito cấp 1,5 g/l, sau đó xác định hàm lượng levan thu được ở các nguồn nito khác nhau.
2.4.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ cấp nito
Sau khi nghiên cứu được các khoảng điều kiện thích hợp (nồng độ sucrose, pH, nguồn nito) chủng vi khuẩn được nuôi cấy ở các nồng độ nito khác nhau. Các nồng độ nito được lựa chọn nghiên cứu bao gồm: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 g/l. Các thông số khác được giữ ở: tốc độ lắc 150 vòng/phút ở 370C trong 24 giờ. Tiến hành xác định hàm lượng levan thu được với các nồng độ cấp nito trong thí nghiệm.
2.4.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp
Sau khi nghiên cứu được các khoảng điều kiện thích hợp (nồng độ sucrose, pH, nguồn nito, nồng độ nito) chủng vi khuẩn được cấp ở các tỷ lệ giống cấp khác nhau. Các tỷ lệ giống cấp được lựa chọn nghiên cứu bao gồm: 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5%. Các thông số khác được giữ ở: tốc độ lắc 150 vòng/phút ở 370C trong 24 giờ. Bố trí thí nghiệm và tính hàm lượng levan thu được.
2.4.1.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Sau khi xác định được các khoảng điều kiện thích hợp như trên, tiến hành nuôi cấy chủng B. subtilis và lắc với các tốc độ: 100, 125, 150 và 175 vòng/phút. Các thông số khác được giữ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ và thí nghiệm được xác định hàm lượng levan theo các tốc độ lắc khác nhau.
2.4.2. Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna và cs, 2013)
Quá trình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan được tiến hành theo quy hoạch Box-Behnken sử dụng phần mềm Design-Expert (State - Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ).
Bước 1. Xây dựng mô hình toán học dạng y = y0 + b1X1 + b11X12 + b2X2 + b22X22 + b3X3 + b33X32 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3.
-Xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ khảo sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã công bố. Các biến số và khoảng chạy của chúng được thể hiện trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Bảng xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi từng biến số
Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1
X1 pH 6 8
X2 Nồng độ nito g/l 1,5 2,5
X3 Tốc độ lắc vòng/phút 100 150
Lập ma trận thực nghiệm theo Box - Behnken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình), trong đó có 5 thí nghiệm lặp lại ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0).
Tiến hành thực nghiệm:
Sinh tổng hợp levan được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy lỏng. Bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường được nuôi trong 24 giờ, sau đó kết tủa và thu nhận levan.
Bước 2. Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kì vọng.
Tìm cực trị của phương trình hồi quy y = b0 + b1X1 +b11X12 + b2X2 + b22X22 + b3X3 + b33X32 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 bằng phần mềm Design-Expert cho kết quả giá trị cực trị tại X1, X2, X3 tương ứng với pH, nồng độ nito và tốc độ lắc.
Do vậy, hàm lượng levan đạt cao nhất tại các giá trị cực trị X1, X2, X3 đó.