VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, phạm vi
2.1.1. Đối tượng
Gia cầm sống (gà, vịt): Lấy mẫu swab (hầu, họng); Mẫu môi trường (mẫu phân tươi, mẫu nước thải, mẫu nước uống, mẫu chất thải trên lông nhốt gia cầm) của gia cầm sống bán tại các chợ (điểm) buôn bán gia cầm của tỉnh Quảng Ninh.
2.1.2. Phạm vi
2.1.2.1. Địa điểm
-Điểm lấy mẫu: phường Minh Thành, chợ Rừng, chợ Trung tâm TP. Cẩm Phả,
chợ Ka Long TP Móng Cái thuộc tỉnh Quảng Ninh.
- Trạm chẩn đoán xét nghiệm bệnh động, thực vật - Chi cục Chăn nuôi và Thú
y tỉnh Quảng Ninh.
Hình 2.1. Bản đồ thể hiện các chợ buôn bán gia cầm sống được lấy mẫu theo không gian
2.1.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 1/2019 đến tháng 6/202
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh cúm gia cầm ở tỉnh Quảng Ninh giai đoạn 2015 – 6/2020
- Sự phân bố bệnh cúm gia cầm và type/subtype gây bệnh tại các huyện, thành, thị của tỉnh Quảng Ninh từ năm 2015 - 6/2020
- Tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Quảng Ninh giai đoạn 2015 – 6/2020 - Tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo mùa
- Tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo loại gia cầm
- Tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo phương thức chăn nuôi - Tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo quy mô đàn gia cầm
2.2.2. Tình hình tiêm vacxin cúm A/H5N1 của tỉnh Quảng Ninh
- Kết quả tiêm phòng vacxin cúm cho đàn gia cầm của tỉnh Quảng Ninh năm 2019 - Kết quả tiêm phòng vacxin cúm cho đàn gia cầm của tỉnh Quảng Ninh nửa đầu năm 2020
- Tình hình tiêm vacxin cúm A/H5N1 tại một số huyện, thị, thàn phố của tỉnh Quảng Ninh
2.2.3. Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ gia cầm sống
- Kết quả lấy mẫu tại các chợ
- Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu giám sát. - Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H5 trong các mẫu giám sát. - Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype N6 trong các mẫu giám sát. - Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 qua các vòng lấy mẫu.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp điều tra dịch tễ học
Phương pháp điều tra hồi cứu được sử dụng nhằm thu thập, tổng hợp thông tin từ các Trung tâm dịch vụ nông nghiệp, Chi cục Chăn nuôi và Thú y Quảng Ninh, Cục thú y về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm và các type/subtype gây bệnh, kết quả tiêm phòng vacxin, kết quả xét nghiệm mẫu giám sát lưu hành tại các chợ và điểm thu gom. Từ đó đánh giá được hiệu quả của việc tiêm phòng vacxin cúm trên thực địa của tỉnh Quảng Ninh.
2.3.2. Phương pháp phân tích dịch tễ học
Phương pháp phân tích dịch tễ học được dùng để đánh giá một số đặc điểm dịch tễ của bệnh cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh.
2.3.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản
Phương pháp lấy mẫu (theo tài liệu hướng dẫn của Cục thú y 2019)
* Phương pháp lấy mẫu swab hầu họng
- Tổng số mẫu swab tại mỗi địa điểm là 06 mẫu.
- Cách lấy: Mỗi con gia cầm lấy 01 (một) mẫu dịch ngoáy hầu, họng. Sau đó, mẫu của 05 con gia cầm đó được cho vào cùng một ống đựng mẫu đã có dung dịch bảo quản virus cúm (mẫu gộp). Cụ thể như sau:
+ Đối với địa điểm có bán nhiều gà và vịt: Lấy 03 mẫu gộp của gà và 03 mẫu gộp của vịt.
+ Đối với địa điểm có bán gà nhiều hơn vịt, ngan (vịt xiêm): Lấy mẫu gà là chủ yếu; chỉ lấy mẫu vịt và ngan (vịt xiêm) nếu địa điểm đó tại thời điểm lấy mẫu có nhiều hơn 05 (năm) con vịt và ngan (vịt xiêm) để bảo đảm có đủ mẫu gộp của 05 con.
+ Đối với địa điểm có bán nhiều vịt, ngan (vịt xiêm) hơn gà: Lấy mẫu vịt, ngan (vịt xiêm) là chủ yếu; chỉ lấy mẫu gà nếu địa điểm đó tại thời điểm lấy mẫu có nhiều hơn 05 (năm) con gà để bảo đảm có đủ mẫu gộp của 05 con.
+ Đối với địa điểm chỉ bán vịt, ngan (vịt xiêm) thì lấy đủ 06 mẫu gộp của vịt, ngan (vịt xiêm).
- Chỉ trộn mẫu của những gia cầm được lấy tại cùng một địa điểm vào trong cùng một ống đựng mẫu, kể cả số lượng gia cầm ít hơn 30 con/điểm lấy mẫu. Không trộn mẫu của gia cầm ở địa điểm này với mẫu của gia cầm ở địa điểm khác.
* Phương pháp lấy mẫu swab môi trường
Mỗi quầy bán gia cầm lấy 05 (năm) mẫu phân mới tại 05 vị trí khác nhau bằng 05 tăm bông. Sau đó bỏ 05 tăm bông này vào trong cùng một ống đựng mẫu có chứa dung dịch bảo quản vi rút cúm.
Trường hợp không có mẫu phân tại thời điểm lấy mẫu thì lấy mẫu swab để bảo đảm đủ số lượng mẫu cho mỗi địa điểm tại mỗi vòng lấy mẫu
Trong quá trình lấy mẫu phải đảm bảo đúng kỹ thuật, tránh lây nhiễm chéo giữa các mẫu bệnh phẩm.
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ gia cầm sống và kỹ thuật chẩn đoán bệnh cúm gia cầm trong phòng thí nghiệm bằng kỹ sống và kỹ thuật chẩn đoán bệnh cúm gia cầm trong phòng thí nghiệm bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Chẩn đoán bệnh cúm gia cầm trong phòng thí nghiệm của Chi cục Thú y vùng II bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)
* Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6
Bước 1: Xét nghiệm tất cả các mẫu (pool) để phát hiện vi rút cúm A.
Bước 2: Tất cả các mẫu (pool) dương tính với virus cúm A tiếp tục được xét nghiệm để phát hiện H5.
Bước 3: Tất cả các mẫu dương tính với virus cúm H5 tiếp tục được xét nghiệm để phát hiện N6.
Mẫu được xác định là dương tính với Real-time RT PCR nếu có giá trị Ct ≤ 38; mẫu được xác định là âm tính nếu không có giá trị Ct; mẫu có giá trị Ct > 38 được coi là mẫu có kết quả nghi ngờ.
Phương pháp này được tiến hành theo quy trình hướng dẫn giám sát ban hành bởi Cục thú y (2019), theo sơ đồ:
Trộn 5 mẫu swabs trong cùng 1 đàn Âm tính dương tính Âm tính dương tính Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu dịch bệnh được tổng hợp và vẽ bản đồ bằng phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ ArcGIS 9.3.
Kết quả xét nghiệm được nhập và xử lý qua MS. Excel năm 2007 tính tỷ lệ dương tính xét nghiệm (tỷ lệ nhiễm p) tính theo công thức:
(trong đó a là số mẫu dương tính; n là tổng số mẫu xét nghiệm).
Mẫu (Swabs, mô) Realtime RT – PCR phát hiện type A Kết luận âm tính Realtime RT – PCR phát hiện subtype H5 Xác định type khác Realtime RT – PCR phát hiện subtype N6 Kết luận bệnh