4. Bố cục của luận án
2.4.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.4.3.1. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Các chủng vi sinh vật được sử dụng để thử hoạt tính: Vi khuẩn gram dương:
Enterococcus faecalis ATCC299212; Staphylococcus aureus ATCC25923; Bacillus cereus ATCC14579; Vi khuẩn gram âm: Escherichia coli ATCC25922;
Pseudomonas aeruginosa ATCC27853; Salmonella enterica ATCC13076; Chủng
nấm men: Candida albican ATCC10231.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha lỗng đa nồng độ [151]. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định nhằm đánh giá mức độ kháng mạnh, yếu của các mẫu thử thơng qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu). Mẫu ban đầu được pha lỗng
trong DMSO (Dimethyl sulfoxit) ở dải nồng độ giảm dần: 256 µg/ml, 128 µg/ml, 64 µg/ml, 32 µg/ml, 16 µg/ml, 8 µg/ml, 4 µg/ml và 2 µg/ml với số thí nghiệm lặp lại
N=3. Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 2×105CFU/ml.
Tiến hành thử: lấy 5,12 l dung dịch mẫu thử cĩ nồng độ 10 mg/ml vào hàng đầu tiên cĩ chứa 94,88 l mơi trường LB rồi pha lỗng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng cĩ chứa 50 l cho đến khi đạt được nồng độ là 2 g/ml, thêm 50 l dung
dịch vi khuẩn và nấm ở nồng độ 2×105 CFU/ml, ủ ở 37oC. Sau 24h, xác định sơ bộ
giá trị MIC. Chất đối chứng là kháng sinh streptomycin và kanamycin cho các chủng vi khuẩn; nistatin và cyclohexamide cho nấm.
MIC được xác định là giếng cĩ nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm ức chế hồn tồn sự phát triển của vi sinh vật, được xác định chính xác dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data. Các giá trị IC50 được xác định bằng tỷ lệ phần trăm vi sinh vật bị kìm hãm sự tăng trưởng dựa trên dữ liệu đo độ đục của máy đo quang phổ BioTeK và phần mềm máy tính Raw data theo các phương trình sau:
% inhibition = ODcontrol(-) x 100%
- ODtest agent ODcontrol(-)- ODcontrol(+)
IC50 = Highconc- (Highinh% - 50%) x (Highconc- Lowconc)
(Highinh%- Lowinh%)
Chú thích: % inhibition: nồng độ ức chế; OD là mật độ quang; Control (-): các tế bào cĩ trong mơi trường khơng cĩ chất chống vi sinh vật; test agent: tác nhân thử nghiệm tương ứng với nồng độ chất chống vi sinh vật đã biết; Control (+): mơi trường nuơi cấy khơng cĩ tế bào; Highconc/Lowconc là tác nhân thử nghiệm ở nồng độ cao/nồng độ thấp; Highinh% /Lowinh% là % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp.
2.4.3.2. Thử hoạt tính kháng ấu trùng muỗi
Hoạt tính kháng ấu trùng muỗi được xác định bằng phương pháp Reed- Muench [152].
Muỗi và ấu trùng: Muỗi trưởng thành Aedes aegypti, Aedes albopictus và
Cules quinquefasciatus được thu thập tại phường Hịa Khánh Nam, quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng (16°03'14,9"N, 108°09'31,2"E). Muỗi trưởng thành được duy trì trong lồng cơn trùng (40 × 40 × 40 cm) và cho ăn 10% dung dịch đường và được cho ăn máu trên chuột. Trứng nở được gây ra với nước máy. Ấu trùng được nuơi trong
các khay nhựa (24 × 35 × 5 cm). Ấu trùng được cho ăn bánh quy chĩ và bột men theo tỷ lệ 3: 1. Tất cả các giai đoạn được thực hiện ở 25 ± 2° C, độ ẩm tương đối 65-75%, và một chu kỳ tối 12: 12 tại Trung tâm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ cao, Đại học Duy Tân.
Hoạt tính diệt ấu trùng muỗi của tinh dầu một số lồi thuộc chi Gừng (Zingiber) và chi Ngải tiên (Hedychium) được đánh giá theo giao thức của WHO (2005) với những thay đổi nhỏ. Đối với khảo nghiệm, phần tinh dầu được hịa tan trong EtOH (dung dịch gốc 1%) được đặt trong cốc 200 mL và được thêm vào nước chứa 20 ấu trùng (instar thứ tư). Với mỗi thử nghiệm, một bộ điều khiển sử dụng EtOH cũng được chạy để so sánh. Tỷ lệ tử vong được ghi nhận sau 24 giờ và sau 48 giờ phơi nhiễm trong khi khơng bổ sung dinh dưỡng. Các thí nghiệm được tiến hành 25 ± 2° C. Mỗi thử nghiệm được tiến hành với bốn lần lặp lại với ba nồng độ (100, 50 và 25 μg/ml). Nồng độ gây chết trung bình (LC50) được xác định bằng phương pháp Reed-Muench.