Sau khi nghiên cứu các điều kiện tách chiết, tiến hành phân tích trên 25 mẫu sản phẩm dinh dưỡng đang lưu hành trên thị trường Hà Nội gồm: mẫu sữa dạng lỏng, sữa dạng bột, bơ, phomat, bột dinh dưỡng. Các mẫu được đồng nhất, sau đó được cân và tiến hành phân tích theo sơ đồ hình 3.13. Mỗi mẫu tiến hành làm lặp lại 2 lần. Kết quả phân tích thu được trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Kết quả phân tích STT Đối tƣợng phân tích Hàm lƣợng Nisin (µg/kg, µg /L ) Nisin A Nisin Z 1 Mẫu 1 KPH KPH 2 Mẫu 2 KPH KPH 3 Mẫu 3 KPH KPH 4 Mẫu 4 106,2 181,4 5 Mẫu 5 KPH KPH 6 Mẫu 6 KPH KPH 7 Mẫu 7 KPH KPH 8 Mẫu 8 KPH KPH 9 Mẫu 9 KPH KPH 10 Mẫu 10 KPH KPH 11 Mẫu 11 KPH KPH 12 Mẫu 12 92,35 95,74 13 Mẫu 13 KPH KPH 14 Mẫu 14 KPH KPH 15 Mẫu 15 KPH KPH 16 Mẫu 16 KPH KPH 17 Mẫu 17 KPH KPH 18 Mẫu 18 KPH KPH 19 Mẫu 19 KPH KPH 20 Mẫu 20 KPH KPH 21 Mẫu 21 KPH KPH 22 Mẫu 22 KPH KPH 23 Mẫu 23 KPH KPH 24 Mẫu 24 KPH KPH 25 Mẫu 25 KPH KPH
Nhận xét: Qua phân tích 25 mẫu cho thấy có 2 mẫu có chứa chất phân tích Nisin A và Nisin Z, kết quả đều đều nằm trong ngưỡng cho phép theo Thông tư 24/2019/TT-BYT. Các mẫu không phát hiện chất phân tích đều cho hiệu suất thu hồi khi thêm chuẩn ở các mức nồng độ 10µg/L; 20µg/L; 50µg/L nằm trong khoảng 80,1- 105%, minh chứng hiệu quả của phương pháp.
KẾT LUẬN
Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu để xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z trong sản phẩm dinh dưỡng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, luận văn đã thu được các kết quả như sau:
1. Đã tối ưu hóa các điều kiện LC –MS/MS để phân tích đồng thời Nisin A và Nisin Z, lựa chọn được các mảnh ion mẹ, ion con để định tính và định lượng của từng chất. 2. Đã tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu, sử dụng hỗn hợp dung dịch đệm amoni acetate
0,1M trong NaCl 1M (pH 2) : MeOH (1:1,v/v) làm dung môi chiết.
3. Đã thẩm định phương pháp về xây dựng đường chuẩn với hệ số tương quan lớn hơn 0,999 đối với cả Nisin A và Z, xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tốt nhất đạt được với Nisin A 5,5µg/kg ; 18,2 µg/kg, Nisin Z 4,9 µg/kg ; 16,4 µg/kg tương ứng. Đánh giá độ chụm với Nisin A (2,12 – 3,52%), Nisin Z (2,65 – 5,77%), độ đúng thông qua độ thu hồi đạt từ (80,1 – 105%), đáp ứng yêu cầu của AOAC.
4. Đã tiến hành phân tích đồng thời Nisin A và Nisin Z trên 25 mẫu (mẫu sữa tươi dạng lỏng, mẫu sữa bột, mẫu bơ, mẫu phomat) được lấy trên địa bàn Hà Nội, kết quả phân tích cho thấy phát hiện một số mẫu có sử dụng chất bảo quản Nisin A, Z trong sản phẩm. Điều đó đã minh chứng cho khả năng áp dụng trên nền mẫu thực tế của phương pháp.
Các kết quả đạt được trên đây là thành công bước đầu nhằm xác định đồng thời hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong các mẫu sữa tươi dạng lỏng, mẫu sữa bột, mẫu bơ, mẫu phomat bằng hương pháp sắc kí lỏng khối phổ. Nghiên cứu dự định sẽ tiếp tục mở rộng nhằm xác định đồng thời các nhóm chất bảo quản như Lysozyme, Hexamethylenetetramine, Nisin khác, đồng thời mở rộng thêm đối tượng nền mẫu như: thịt, rau, sản phẩm đóng hộp, đồ uống.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Phan Thị Khánh Hoa, Nghiên cứu sinh tổng hợp nisin từ vi khuẩn Lactoccocus lactics subsp. lactics 11, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Bộ Công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm.
2. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
3. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 10137:2013, Xác định hàm lượng Nisin A bằng sắc ký lỏng – phổ khối lượng (LC-MS) và sắc ký lỏng – phổ khối lượng hai lần (LC- MS-MS), Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
TIẾNG ANH
4. Abts, A., et al. (2011), “Easy and rapid purification of highly active nisin”, International journal of peptides, p.1-9.
5. Additives, E.P.o.F., et al. (2017), ''Safety of nisin (E 234) as a food additive in the light of new toxicological data and the proposed extension of use'', European Food Safety Authority Journal, 15(12) : p.50-63.
6. And, H.C. and D. Hoover (2003), ''Bacteriocins and their food applications'',
Comprehensive reviews in food science and food safety, 2(3), p.82-100.
7. Bailey, F. and A. Hurst (1971), ''Preparation of a highly active form of nisin from Streptococcus lactis'', Canadian Journal of Microbiology, 17(1), p.61-67.
8. Blackburn P., Polak, J., Guisik S., Rubino S. D. (1989). Nisin composition for use asenhenced, broad range Bacterioxin, International patent application number PCT/US89/02625: International publication number W89/12399. Appl. Microbiol, New York.
9. Bouksaim, M., et al. (2000), ''Effects of mixed starter composition on nisin Z production by Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis UL 719 during production and ripening of Gouda cheese'', International journal of food microbiology, 59(3), p.141-156.
10. Bouksaim, M., et al. (1999), ''Production and utilization of polyclonal antibodies against nisin in an ELISA and for immuno‐location of nisin in producing and sensitive bacterial strains'', Journal of applied microbiology, 87(4), p.500-510.
11. Bouttefroy, A. and J.-B. Millière (2000), ''Nisin–curvaticin 13 combinations for avoiding the regrowth of bacteriocin resistant cells of Listeria monocytogenes ATCC 15313'', International Journal of Food Microbiology, 62(1-2), p.65-75.
12. Chinachoti, N. (1997), Studies on the efficient production of nisin Z by Lactococcus lactis IO-1 (JCM 7638), The faculty of Agricultrure Kyushu University.
13. Cleveland, J., et al. (2001), ''Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation'', International journal of food microbiology, 71(1), p.1-20.
14. De Kwaadsteniet, M., K. Ten Doeschate, and L. Dicks (2008), ''Characterization of the structural gene encoding nisin F, a new lantibiotic produced by a Lactococcus lactis subsp. lactis isolate from freshwater catfish (Clarias gariepinus)'', Applied and Environmental Microbiology, 74(2), p.547-549.
15. Delves-Broughton, J. (1998), ''Use of nisin in processed cheese and natural cheese: Commission B: Technology and engineering'', Bulletin-International Dairy Federation, 329, p.13-17.
16. Delves-broughton, J. (2005), ''Nisin as a food preservative'', Food Australia, 57(12), p.525-527.
17. Delves-Broughton, J., et al. (1996), ''Applications of the bacteriocin, nisin'', Antonie Van Leeuwenhoek, 69(2), p.193-202.
18. Delves-Brougthon, J. (1990), ''Nisin and its uses as a food preservative'', Food technology, 44(11), p.100-117.
19. Desmazeaud, M. (1996), “Growth inhibitors of lactic acid bacteria in Dairy starter cultures”, TM. Cogan and J.P.Accolas, p.131-155.
20. Dodd, H. and M. Gasson 1994), “Bacteriocins of lactic acid bacteria, Genetics and biotechnology of lactic acid bacteria”, Genetics and biotechnology of lactic acid bacteria, Blankie Academic and Professiona, p.211-251.
21. Dusemund, B., et al. (2012), “Food additives and nutrient sources added to food”, EFSA Journal, Parma, Italy, 10(10), p.1-24.
22. Emerton, V. and E. Choi (2008), Essential guide to food additives, Royal Society of Chemistry.
23. Falahee, M., et al. (1990), ''An enzyme immunoassay for nisin'', International journal of food science & technology, 25(5), p.590-595.
24. Fowler, G. and F. GG (1975), ''The assay of nisin in foods'', SOC. APPL. BACTERIOL., TECH. SER.; G.B.; DA, 8; pp. 91-105.
25. Fuselli, F., et al. (2012), ''Multi-detection of preservatives in cheeses by liquid chromatography–tandem mass spectrometry'', Journal of Chromatography B, 906, p.9-18.
26. Garriga, M., et al. (1993), ''Bacteriocinogenic activity of lactobacilli from fermented sausages'', Journal of Applied Bacteriology, 75(2), p.142-148.
27. Gross, Erhard, and John L. Morell. (1971), "Structure of nisin", Journal of the American Chemical Society, 93(18), 4634-4635.
28. Guo, W., et al. (2010), ''Optimization of fermentation medium for nisin production from Lactococcus lactis subsp. lactis using response surface methodology (RSM) combined with artificial neural network-genetic algorithm (ANN-GA)'', African Journal of Biotechnology, 9(38), p.6264-6272.
29. Hakovirta, J., J. Reunanen, and P. Saris (2006), ''Bioassay for nisin in milk, processed cheese, salad dressings, canned tomatoes, and liquid egg products'', Applied and environmental microbiology, 72(2), p.1001-1005.
30. Hansen, J.N., et al. (1991), “Biosynthesis and mechanism of action of nisin and subtilin”, Nisin and novel lantibiotics, 88, p.287-302.
31. Harris, L.J., H. Fleming, and T. Klaenhammer (1992), ''Characterization of two nisin-producing Lactococcus lactis subsp. lactis strains isolated from a commercial sauerkraut fermentation'', Applied and environmental microbiology, 58(5), p.1477-1483.
32. Hauben, K.J., et al. (1996), ''High-pressure transient sensitization of Escherichia coli to lysozyme and nisin by disruption of outer-membrane permeability'', Journal of Food Protection, 59(4), p.350-355.
33. Hirsch, A. (1951), ''Growth and nisin production of a strain of Streptococcus lactis'',
Microbiology, 5(1), p.208-221.
34. Hurst, A. (1981), “Nisin”, Advances in applied microbiology. Academic Press, 27 p.85-123.
35. Hutzler, M., et al. (2015), “Yeast identification and characterization, in Brewing Microbiology”, Wood head Publishing, pp. 65-104.
36. JECFA, F. (2009), ''Specifications for Nisin Preparation,71st JECFA'', Monograph, 7, p.1-5.
37. Jones, E., V. Salin, and G.W. Williams (2005), Nisin and the market for commercial bacteriocins, Texas Agribusiness Market Research Center (TAMRC) Consumer and Product Research Report.
38. Ko, K.Y., et al. (2015), ''Analysis method for determination of nisin A and nisin Z in cow milk by using liquid chromatography-tandem mass spectrometry'', Journal of Dairy Science, 98(3), p.1435-1442.
39. Leroy, F. and L. De Vuyst (2004), ''Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry'', Trends in Food Science & Technology, 15(2), p.67-78.
40. Liu, W. and J.N. Hansen (1990), ''Some chemical and physical properties of nisin, a small-protein antibiotic produced by Lactococcus lactis'', Applied and environmental microbiology, 56(8), p.2551-2558.
41. Matsusaki, H., et al. (1995), “Purification and identification of a peptide antibiotic produced by Lactococcus lactis IO-1”, Journal of the Faculty of Agriculture-Kyushu University (Japan), Vol 40, p.73-85.
42. Mattick, A. and A. Hirsch (1947), ''Further observations on an inhibitory substance (nisin) from lactic streptococci'', Lancet, 5, p.5-8.
43. Mulders, J.W., et al. (1991), ''Identification and characterization of the lantibiotic nisin Z, a natural nisin variant'', European Journal of Biochemistry, 201(3), p.581-584. 44. Müller-Auffermann, K., et al. (2015), ''Nisin and its usage in breweries: a review and
discussion'', Journal of the Institute of Brewing, 121(3), p.309-319.
45. O'Connor, P.M., et al. (2015), ''Nisin H is a new nisin variant produced by the gut- derived strain Streptococcus hyointestinalis DPC6484'', Applied and Environmental Microbiology, 81(12), p.3953-3960.
46. O'Mahony, A., et al. (2000), ''Characterisation of antimicrobial producing lactic acid bacteria from malted barley'', Journal of the Institute of Brewing, 106(6), p.403-410. 47. Pawar, D., et al. (2000), ''Effect of nisin and its combination with sodium chloride on the
survival of Listeria monocytogenes added to raw buffalo meat mince'', Meat Science, 56(3), p.215-219.
48. Pongtharangkul, T. and A. Demirci (2004), ''Evaluation of agar diffusion bioassay for nisin quantification'', Applied microbiology and biotechnology, 65(3), p.268-272. 49. Rauch, P. and W.M. De Vos (1992), ''Characterization of the novel nisin-sucrose
conjugative transposon Tn5276 and its insertion in Lactococcus lactis'', Journal of Bacteriology, 174(4), p.1280-1287.
50. Reunanen, J. (2007), Lantibiotic nisin and its detection methods,University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Applied Chemistry and Microbiology.
51. Rogers, L. and E. Whittier (1928), ''Limiting factors in the lactic fermentation'', Journal of Bacteriology, 16(4), p.211.
52. Rollema, H.S., et al. (1995), ''Improvement of solubility and stability of the antimicrobial peptide nisin by protein engineering'', Applied and environmental microbiology, 61(8), p.2873-2878.
53. Ruhr, E. and H.-G. Sahl (1985), ''Mode of action of the peptide antibiotic nisin and influence on the membrane potential of whole cells and on cytoplasmic and artificial membrane vesicles'', Antimicrobial agents and chemotherapy, 27(5), p.841-845. 54. Rulis, A. (2001), ''Agency Response Letter GRAS Notice No. GRN 000074'', Food and
Drug Administration, p.1-3.
55. Schillinger, U., R. Geisen, and W. Holzapfel (1996), ''Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods'', Trends in Food Science & Technology, 7(5), p.158-164.
56. Schleifer, K., et al. (1985), ''Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen. nov'', Systematic and Applied Microbiology, 6(2), p.183-195.
57. Schneider, N., K. Werkmeister, and M. Pischetsrieder (2011), ''Analysis of nisin A, nisin Z and their degradation products by LCMS/MS'', Food chemistry, 127(2), p.847-854.
58. Soliman, L.C. and K.K. Donkor (2010), ''Method development for sensitive determination of nisin in food products by micellar electrokinetic chromatography'',
59. Sonomoto, K., et al. (2000), ''Biosynthetic production of nisin Z by immobilized Lactococcus lactis IO-1'', Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 10(1-3), p.325-334.
60. Stanley, B., et al. (2009), ''Separation and determination of closely related lantibiotics by micellar electrokinetic chromatography'', Journal of separation science, 32(17), p.2993-3000.
61. Suárez, A.M., et al. (1996), ''Development of monoclonal antibodies to the lantibiotic nisin A'', Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(9), p.2936-2940.
62. TODD, E.C. (1996), ''Worldwide surveillance of foodborne disease: the need to improve'', Journal of food protection, 59(1), p.82-92.
63. Tramer, J. and G. Fowler (1964), ''Estimation of nisin in foods'', Journal of the Science of Food and Agriculture, 15(8), p.522-528.
64. Twomey, D., et al. (2002), ''Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications'', Antonie Van Leeuwenhoek, 82(1-4), p.165-185.
65. Vandenbergh, P.A. (1993), ''Lactic acid bacteria, their metabolic products and interference with microbial growth'', FEMS Microbiology Reviews, 12(1-3), p.221-237.
66. Wirawan, R.E., et al. (2006), ''Molecular and genetic characterization of a novel nisin variant produced by Streptococcus uberis'', Applied and Environmental Microbiology, 72(2), p.1148-1156.
67. Wolf, C. and W. Gibbons (1996), ''Improved method for quantification of the bacteriocin nisin'', Journal of applied bacteriology, 80(4), p.453-457.
68. Zendo, T., et al. (2003), ''Identification of the lantibiotic nisin Q, a new natural nisin variant produced by Lactococcus lactis 61-14 isolated from a river in Japan'',
PHỤ LỤC
Phụ lục A: Quy định của AOAC về độ lặp lại và độ thu hồi
Phụ lục A1. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) 0,01 10-4 100 ppm 5,3 0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 1 ppm 11 0,00001 10-7 100 ppb 15 0,000001 10-8 10 ppb 21 0,0000001 10-9 1ppb 30
Phụ lục A2. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi [%]
0,01 10-4 100 ppm 90 - 107 0,001 10-5 10 ppm 80 - 110 0,0001 10-6 1 ppm 80 - 110 0,00001 10-7 100 ppb 80 - 110 0,000001 10-8 10 ppb 60 - 115 0,0000001 10-9 1ppb 40 - 120
Phụ lục B: Sắc đồ của Nisin A và Nisin Z
Phụ lục 1. Sắc đồ chuẩn Nisin A và Nisin Z
Hình P.1.1. Sắc đồ chuẩn của Nisin A
Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát thành phần acid formic trong pha động
Hình P2.1. Sắc đồ Nisin A, Z tại acid formic 0%
Hình P2.2. Sắc đồ Nisin A, Z tại acid formic 0,05%
Hình P2.3. Sắc đồ Nisin A, Z tại acid formic 0,1%
Hình P2.5. Sắc đồ Nisin A, Z tại acid formic 0,3%
Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát nồng độ dung dịch đệm
Hình P 3.1. Sắc đồ Nisin A, Z tại nồng độ đệm CH3COONH4 – NaCl: 0,05 – 0,5 M
Hình P 3.2. Sắc đồ Nisin A, Z tại nồng độ đệm CH3COONH4 – NaCl: 0,1 – 1 M
Hình P 3.4. Sắc đồ Nisin A, Z tại nồng độ đệm CH3COONH4 – NaCl: 0,4 – 4M
Phụ lục 4: Sắc đồ khảo sát pH của dung dịch đệm
Hình P 4.1. Sắc đồ Nisin A, Z tại pH = 2,0
Hình P 4.2. Sắc đồ Nisin A, Z tại pH = 2,5
Hình P 4.4. Sắc đồ Nisin A, Z tại pH = 4,0 Hình P 4.5. Sắc đồ Nisin A, Z tại pH = 5,0 Hình P 4.6. Sắc đồ Nisin A, Z tại pH = 6,6
Phụ lục 5: Sắc đồ khảo sát tỉ lệ dung môi chiết
Hình P 5.2. Sắc đồ Nisin A, Z với tỷ lệ dung môi chiết 1/1
Hình P 5.3. Sắc đồ Nisin A, Z với tỷ lệ dung môi chiết 1/2
Phụ lục 6: Sắc đồ khảo sát số lần chiết
Hình P 6.1. Sắc đồ Nisin A, Z khảo sát với 1 lần chiết