Tốc độ rửa giải qua cột chiết pha rắn ảnh hưởng khá lớn đến hiệu suất chiết. Nếu tốc độ rửa giải quá lớn sẽ phải sử dụng một lượng lớn dung môi, dễ kéo đi mất chất phân tích làm hiệu suất chiết giảm. Còn nếu tốc độ rửa giải thấp sẽ kéo dài thời gian phân tích mẫu. Do đó, trong nghiên cứu tiến hành khảo sát với 3 tốc độ: 3mL/phút; 2mL/phút; 1mL/phút để tìm tốc độ rửa giải phù hợp. Kết quả phân tích như hình 3.11.
Hình 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ rửa giải
Từ các kết quả chỉ ra ở hình 3.11 nhận thấy, tốc độ rửa giải càng nhỏ càng tốt, tuy nhiên mất nhiều thời gian phân tích và hệ số thu hồi giữa 1 mL/phút và 2 mL/phút
chênh lệch không đáng kể. Do vậy để tiết kiệm thời gian, trong nghiên cứu đã lựa chọn tốc độ rửa giải 2mL/phút để rửa giải chất phân tích và cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.8. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải qua cột chiết pha rắn
Lượng dung dịch rửa giải phải đủ lớn để chất phân tích có thể được rửa giải ra khỏi cột hoàn toàn. Qua tham khảo tài liệu trong nghiên cứu đã lựa chọn hỗn hợp dung môi IPA – TFA 0,1% (70/30, v/v). Sử dụng nền mẫu sữa lỏng không phát hiện Nisin A và Nisin Z, thêm chuẩn hỗn hợp ở nồng độ 100µg/L, tiến hành khảo sát tại các thể tích rửa giải khác nhau là: 2mL, 4mL, 6mL hỗn hợp dung môi IPA – TFA 0,1% (70/30, v/v). Kết quả phân tích như hình 3.12.
Hình 3.12. Đồ thị khảo sát thể tích dung dịch rửa giải
Kết quả cho thấy khi rửa giải với thể tích 2mL và 4mL cho hiệu suất thu hồi thấp vì chưa rửa giải được hết chất phân tích, khi rửa giải với thể tích 6mL cho hiệu suất thu hồi cao nhất. Do đó, trong nghiên cứu đã lựa chọn thể tích rửa giải 6mL. Sau khi đã tối ưu hóa các điều kiện phân tích, quy trình phân tích tối ưu được xây dựng như trong sơ đồ hình 3.13.
Quy trình phân tích mẫu tối ƣu nhƣ sau:
Hình 3.13. Sơ đồ quy trình tối ưu phân tích Nisin
Ly tâm 6000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ 4oC Cân mẫu khoảng 2 -5 g/ ống ly tâm 50mL
Rung siêu âm 10 p hút ở nhiệt độ phòng
Định mức tới vạch 50mL
Thêm 30ml dung dịch đệm acetate 0.1 M - NaCl 1M (pH 2,0) và MeOH (v/v,1:1)
Đồng nhất, lắc trên máy votex 1 phút
Dịch chiết lần 1 Cặn còn lại
Thêm 10mL dung môi chiết votex 1 phút
Gộp dịch chiết lần 1, lần 2
Phân tích trên LC-MS/MS
Hoạt hóa cột: 3ml MeOH, 3ml H2O
Qua cột C18 đã hoạt hóa
Nạp mẫu qua cột
Dịch thu được lọc qua màng lọc 0,2µm votex 1 phút Chiết lặp lại votex 1 phút Rửa tạp 6mL EtOH Rửa giải 6mL hỗn hợp dung môi 70% IPA: 30% acid TFA
0,1% Ly tâm 6000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ 4oC
Cân mẫu khoảng 2 -5 g/ ống ly tâm 50mL
Rung siêu âm 10 phút hút ở nhiệt độ phòng
Định mức tới vạch 50mL
Thêm 30ml dung dịch đệm acetate 0.1 M - NaCl 1M (pH 2,0) và MeOH (v/v,1:1)
Đồng nhất, lắc trên máy votex 1 phút
Dịch chiết lần 1 Cặn còn lại
Thêm 10mL dung môi chiết votex 1 phút
Gộp dịch chiết lần 1, lần 2
Phân tích trên LC-MS/MS
Hoạt hóa cột: 3mL MeOH, 3mL H2O
Qua cột C18 đã hoạt hóa
Nạp 6mL mẫu
Dịch thu được lọc qua màng lọc 0,22µm votex 1 phút
Chiết lặp lại