Đã có rất nhiều phương pháp đã được nghiên cứu để định lượng nhóm chất bảo quản này trên các đối tượng như phô mai, sữa, và các sản phẩm của sữa… Dưới đây là một số phương pháp phổ biến đã được sử dụng. Trong nước, phương pháp sắc kí lỏng ghép nối khối phổ đã được ban hành thành tiêu chuẩn để xác định Nisin A trong phomat [3].
1.3.1. Phƣơng pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA(Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Nisin chuẩn được cộng hợp với enzyme, tạo thành phức hợp Nisinenzyme và được sử dụng như một kháng nguyên ở nồng độ nhất định, cạnh tranh với Nisin có trong mẫu. Kháng thể đặc hiệu với Nisin được gắn lên bề mặt giếng nhựa polystryren. Dịch chiết mẫu trong 0,05% Tween 20 trong dung dịch muối đệm phosphat 0,01 M pH =7,2 được trộn cộng hợp với Nisin – enzyme và được cho vào giếng có phủ kháng thể, các Nisin có trong mẫu (nếu có) sẽ cạnh tranh với phức hợp Nisin- enzyme để gắn vào kháng thể cố định trên polystryren. Sau đó rửa sạch các phức hợp thừa, cơ chất phản ứng với enzyme được đưa vào tạo màu. Ủ một thời gian sau đó thêm vào dung dịch ngưng phát màu để tạo điều kiện đồng đều về thời gian cho mọi giếng. Tiến hành đo độ hấp thụ của mẫu và dãy chuẩn bằng máy đo màu,
từ đó tính được nồng độ của Nisin có trong mẫu. Màu càng đậm chứng tỏ cộng hợp Nisin – enzyme được giữ trong giếng càng nhiều, đồng nghĩa với nồng độ Nisin trong mẫu càng thấp. Ngược lại, màu càng nhạt thì nồng độ Nisin càng cao.
Tác giả Falahee; A. Morris cùng cộng sự [23], sử dụng kháng huyết thanh đa dòng để xác định Nisin A. Cân khoảng 25 ± 0,1g mẫu pho mat, hòa tan trong 10 ml dung dịch HCl 0,02 M. Chỉnh pH 2,0 ± 0,1. Mẫu được gia nhiệt ở 98°C trong 5 phút. Sau khi làm lạnh đến 20oC, đưa về thể tích 12,5ml bằng dung dịch HCl 0,02M và được ly tâm 4000 vòng trong 20 phút ở 4°C. Để ở 4 - 7°C trong 30 phút và lọc qua hai lần lớp giấy lọc Whatman để thu được dịch lọc trong. Tiến hành phân tích trên ELISA. Kết quả thu được so sánh với kết quả từ xét nghiệm sinh học. Phương pháp này có giới hạn phát hiện là 250µg/L, hiệu suất thu hồi đạt 85% và tương quan tốt với xét nghiệm sinh học.
Bouksaim; E. Simard cùng cộng sự [10], sử dụng kháng thể đa dòng Nisin cụ thể (PAb) được tạo ra ở thỏ để xác định Nisin Z. Lấy khoảng 2-5mL sữa tươi hòa tan trong 10 ml dung dịch HCl 0,02M. Điều chỉnh pH 2,0 ± 0,1 bằng acid HCl 6N. Các mẫu được gia nhiệt đến 100°C trong 5 phút. Sau khi làm lạnh đến 20°C, đưa về thể tích 12,5ml bằng dung dịch HCl 0,02M và được ly tâm 4000 vòng trong 20 phút ở 4°C. Để ở nhiệt độ 4 - 7°C trong 30 phút và được lọc qua bộ lọc vô trùng Sartorius MinisartR 0,22µm (Sartorius AG, Gottingen, Đức) để thu được dịch chiết trong. Trước khi thử nghiệm ELISA, tất cả các mẫu được điều chỉnh về pH 6,0 bằng cách sử dụng NaOH 6N. Các dung dịch chiết xuất từ sữa, không thêm Nisin Z, đã được chuẩn bị như trên và được sử dụng làm mẫu chứng không có Nisin trong thử nghiệm ELISA. Các mẫu sữa được lọc trực tiếp qua bộ lọc Sartorius 0,22 µm, được điều chỉnh đến pH 6,0 và phân tích sau khi được bổ sung Nisin Z như trên. Phương pháp này có giới hạn phát hiện là LOD 1,7µg/L, hiệu suất thu hồi đạt 50–63%.
Suarez; AzconaOlivera cùng cộng sự [61] đã mô tả một thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết trực tiếp với enzym (CD - ELISA) cho Nisin A và Nisin Z trong pho
mát, sữa và váng sữa dựa trên các kháng thể đơn dòng của chuột với quy trình chiết mẫu thực hiện như mô tả của M.B.Falahee, A. Morris cùng cộng sự [24]. Giới hạn phát hiện 5–10 µg/L. Hiệu suất thu hồi đạt 116,5%. Phương pháp này đơn giản, tiết kiệm dung môi, nhạy hơn đáng kể so với phương pháp xét nghiệm sinh học nhưng nó không hoàn toàn đáng tin cậy do phản ứng chéo với Subtilin một chất có công cấu trúc gần giống với Nisin, gây ra hiện tượng âm tính và dương tính giả, mặt khác nó phát hiện cả Nisin có hoạt tính sinh học và các phân tử phân hủy không hoạt động của nó. Do vậy, việc xác nhận các mẫu dương tính bằng phương pháp LC/MS-MS là rất cần thiết.
1.3.2. Phƣơng pháp sắc kí lỏng kết nối với detector UV
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất giữa hai pha luôn tiếp xúc với nhau. Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao còn pha tĩnh là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 - 7 μm. Một số loại detector dùng trong HPLC như: Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS), detector huỳnh quang (RF), detector độ dẫn, detector mảng diot (DAD), detector khối phổ (MS). Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC với cột tách pha đảo đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất.
Tác giả Delves-Broughton and Friis (1998) [15], Matusaki cùng cộng sự (1995) [41] đã phát triển phương pháp HPLC với detector UV- Vis để xác định Nisin A. Chuẩn bị dung dịch Nisin chuẩn từ Nisin (Sigma): từ dung dịch chuẩn (nồng độ Nisin 2,5 g/L Nisin); pha loãng bằng dung dịch HCl 0,02 N để có các nồng độ Nisin (µg/L): 0,05; 0,125; 0,25; 0,75; 1. Sử dụng cột C18 pha đảo (Inertsil ODS-2/4.6x250 mm). Pha động gồm acetonitrile (dung dịch A) và acid TFA 0,1% (dung dịch B) tốc độ bơm 1mL/phút với chương trình rửa giải gradient : 0,01 phút - ACN 20% ; 10 phút - ACN 20% ; 30 phút - ACN 45% ; 50 phút - ACN 100% ; 55 phút - ACN 100% ; 60phút - ACN 20% và 70 phút - ACN 20%. Detector UV tại bước sóng 254nm. Thời gian lưu của Nisin là
26,5 phút. Giới hạn phát hiện LOD 0,25mg/kg. Giới hạn định lượng LOQ 10mg/L. Tuy nhiên ở phương pháp này chưa có một quy trình cụ thể nào để xác định Nisin A, Z trên mẫu thực tế.
1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản
Nguyên tắc của kỹ thuật điện di mao quản (CE) là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển) của các phân tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong ống mao quản (đường kính 30 - 200 μm) trên nền dung dịch chất điện ly và chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường xác định được cung cấp bởi một nguồn cao thế một chiều ( 10 – 50 KV) đặt vào hai đầu mao quản. Phương pháp CE có ưu điểm là lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản hơn nhiều so với kỹ thuật phân tích HPLC.
Tác giả Soliman and Donkor 2010 [58], đã phát triển phương pháp điện di mao quản và định lượng Nisin A trong các sản phẩm thực phẩm và đồ uống có cồn. Tất cả các mẫu thực phẩm được làm tinh khiết bằng cách sử dụng các đơn vị ly tâm trọng lượng phân tử cụ thể tùy thuộc vào độ nhớt và độ phức tạp của chất nền. Thời gian lọc khác nhau giữa các mẫu. Thời gian lọc tối thiểu là khoảng 10 phút đối với các mẫu ít nhớt hơn như rượu vang đỏ và bia. Sau đó được xác định bằng điện di mao quản vùng: cột mao quản silica (có chiều dài 50cm x 50µm ID), nhiệt độ không đổi ở 25oC, pha động: đệm natri phosphat 50mM, natri dodecyl sulphat (SDS) 80mM, pH 3,75; thế tách 20kV; detector UV 214 nm cho phép phát hiện thành công Nisin A trong vòng 6 phút. Hiệu suất thu hồi từ 83% đến 104%. Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) lần lượt nằm trong khoảng 0,3–0,8mg/L và 1,0–2,8mg/L.
Standley et al. 2009 và cộng sự [60], đã ứng dụng và phát triển phương pháp điện di mao quản để định lượng các chất phân tích như Nisin A, Gallidermin, Duramycin và Cinnamycin trong nền mẫu bia, sữa. Tất cả các mẫu thực phẩm được làm tinh khiết bằng cách sử dụng các đơn vị ly tâm trọng lượng phân tử cụ thể tùy thuộc vào độ nhớt và độ phức tạp của chất nền. Thời gian lọc khác nhau giữa các mẫu.
Sau đó được xác định bằng điện di mao quản vùng: cột mao quản silica (có chiều dài hiệu dụng là 41 cm và tổng chiều dài 52 cm x 50 µm ID), pha động: đệm natri phosphat 50 mM, natri dodecyl sulphat (SDS) 80mM, pH 3,95; thế tách -15kV; detector UV 214nm cho phép phát hiện thành công Nisin A, Gallidermin, Duramycin và Cinnamycin trong vòng 12 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) Gallidermin 61 ng/mL, Cinnamycin 57ng/mL, Duramycin 55ng/mL, Nisin A58 ng/mL. Hiệu suất thu hồi từ 86,1% đến 99,6%.
Mặc dù phương pháp này hiệu quả, nhạy và nhanh chóng, không cần chiết phức tạp tuy nhiên phương pháp này mới chỉ xác định được Nisin A mà chưa xác định được đồng thời cả Nisin Z. Hệ thống thiết bị còn hạn chế tại các phòng thí nghiệm. Việc xây dựng phương pháp xác định đồng thời cả Nisin A và Nisin Z là rất cần thiết.
1.3.4. Phƣơng pháp sắc kí lỏng với detector khối phổ LC – MS/MS
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ là một kĩ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây. Về cơ bản, nó là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ. Sau khi qua cột tách các hợp chất hữu cơ trung hòa bị ion hóa thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion được đưa sang bộ phận tách khối lượng. Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hang dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính, định lượng chất phân tích một cách chính xác. Phương pháp có này có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí lỏng thường không làm được.
N. Schneider, K. Werkmeister, M. Pischetsrieder 2011 [57], đã ứng dụng và phát triển phương pháp sắc kí lỏng khối phổ để xác định Nisin A và Nisin Z trong phô mai chế biến. Quá trình chuẩn bị mẫu gồm có việc chiết Nisin ra khỏi mẫu bằng sử dụng hỗn hợp acid formic 0,5% trong đó có 2 μg/mL of BSA và 20% acetonitrile trong
nước pH = 2,0, sau đó được điều chỉnh về pH = 4,6; lọc qua màng lọc và đem phân tích LC – MS/MS. Điều kiện chạy máy pha động kênh A là acid formic 0,1% (v/v), kênh B acetonitrile 100%. Mảnh pic đặc trưng cho cấu trúc của Nisin A và Nisin Z là mảnh m/z 671,7 và 667,2 tương ứng, mảnh dùng để định lượng là mảnh 810,9 đối với Nisin A; Nisin Z là mảnh m/z 804,9. Hiệu suất thu hồi từ 48 – 68%. Phương pháp này xác định cả Nisin A và Nisin Z nhưng hiệu suất thu hồi thấp, quá trình xử lý mẫu phức tạp. Nên việc áp dụng để xác định trong các mẫu thực phẩm còn hạn chế.
Fabio Fuselli và cộng sự 2012 [25], đã ứng dụng và phát triển phương pháp để xác định đồng thời nhóm chất bảo quản bao gồm acid Benzoic, acid Citric, Hexamethylenetetramine, Lysozyme, Natamycin, Nisin và acid Sorbic trong phô mai. Mẫu được chiết bằng hỗn hợp đệm gồm dung dịch NaCl 1M pha trong acid acetic 0,1M (pH = 4,5): Methanol 100% với tỉ lệ (2/1 v/v). Mẫu được rung siêu âm 10 phút và li tâm ở tốc độ 4000rpm trong vòng 5 phút và lọc qua màng lọc cỡ 0,45µm. Phương pháp tách được 7 chất bảo quản trên trong vòng 22 phút thông qua theo dõi nguồn ion hóa phun electron ESI+. Đường chuẩn được xây dựng trên nền mẫu thực để loại trừ ảnh hưởng nền mẫu trong quá trình ion hóa, phương pháp có hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 0,9909 – 0,999 và khoảng tuyến tính rộng từ 5 – 500mg/kg, độ thu hồi đạt từ 82 - 103% cho tất cả các chất bảo quản trên. Trong phương pháp này tác giải đã khảo sát và lựa chọn cột C8 (150 mm × 4,6 mm i.d., 300 A˚, 5 µm) và cột bảo vệ (ODS, 4 mm × 2,1 mm i.d.). Hai kênh pha động sử dụng là kênh A 0,05% TFA trong acetonitrile (v/v) và kênh B acid TFA 0,05% (v/v). LOD < 1mg/kg, MDLNisin = 0,02 mg/kg, MQLNisin = 0,07mg/kg. Kết quả phân tích một số mãu phô mai cho thấy hàm lượng của các chất bảo quản đều dưới nồng độ được ghi trên nhãn mác bao bì công bố của nhà sản xuất. Riêng có một mẫu xác định Nisin có hàm lượng bất thường. Tuy nhiên phương pháp này chỉ xác định được Nisin A mà chưa đưa ra được phương pháp tối ưu để xác định cả Nisin Z.
Năm 2015 Kyung Yuk Ko, So Ra Park cùng cộng sự [38], đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp tối ưu để xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z trong sữa bò. Mẫu được chiết bằng hỗn hợp dung dịch đệm bao gồm dung dịch amoni acetate 0,1M pha trong NaCl 1M (pH 2)/Methanol(1/1 v/v). Sau đó dung dịch được lọc qua màng lọc 0,20μm. Trong phương pháp này tác giả đã sử dụng cột CW-C18 (50×2mm, 3 μm; t0¢ột 400C), pha động; kênh A acid formic 0,1% và acetonitrile 100% với chương trình rửa giải gradient. Phương pháp có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính từ 12,5 đến 250 μg/kg. Giới hạn phát hiện LOD Nisin A, Nisin Z tương ứng 4,3 và 3,6 μg/kg, giới hạn định lượng LOQ 12,9 and 10,9 μg/kg tương ứng. Hiệu suất thu hồi 80 – 113%. Ngoài định tính chất bằng thời gian lưu thì ưu điểm của phương pháp là xác nhận chính xác chất bằng sự phân mảnh phổ, mảnh pic đặc trưng cho cấu trúc của Nisin A là mảnh m/z 810,9; Nisin Z là mảnh m/z 804,9 dùng để định lượng.
Bộ Khoa học và công nghệ đã ban hành Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10137:2013 (ISO/TS 27106:2009)[3], xác định Nisin A trong phomat bằng phương pháp sắc ký lỏng – phổ khối lượng (LC-MS) và sắc ký lỏng – phổ khối lượng hai lần (LC-MS-MS). Nisin A trong mẫu phomat được chiết tách bằng dung dịch acid formic ở 800C. Protein gây nhiễu được tách ra bằng cách lọc qua màng siêu lọc UF. Trong dịch chiết đã tinh sạch, Nisin A được tách bằng cách sử dụng pha tĩnh trùng hợp và dịch chiết được đưa vào hệ thống HPLC cột pha đảo PLRP – S(150mm x 2mm, 300A0, 3µm). Dung môi rửa giải theo chương trình gradient. Phát hiện và định lượng bằng detector khối lượng với chế độ ion hóa ESI+. Giới hạn phát hiện của phương pháp chưa được quy định, nhưng theo kinh nghiệm giới hạn định lượng thấp nhất của Nisin A là 1mg/kg. Tuy nhiên phương pháp này chỉ có thể xác định được Nisin A mà không xác định được đồng thời Nisin A và Nisin Z, quy trình chiết mẫu phức tạp.
Như vậy, có rất nhiều phương pháp phân tích đã được sử dụng để xác định Nisin A và Nisin Z trong thực phẩm. Dưới đây là một số kết quả xác định Nisin A và Nisin Z được trình bày tóm tắt trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Bảng tóm tắt một số nghiên cứu xác định Nisin A và Nisin Z bằng các phương pháp khác nhau.
Tác giả Nền mẫu PP phân tích Các chất PT Hiệu suất thu hồi (%) LOD/ LOQ M . B . Falahee, B. A . Morris cùng cộng sự (1990) [24]
Phomat ELISA Nisin A 85 LOD 250 µg/L Ana M. Suarez, Azcona - Olivera cùng cộng sự (1996) [56]
Phomat ELISA Nisin A 116,5
LOD 10 µg/L Bouksaim, E. Simard cộng sự (1999) [10]
Bơ, Sữa ELISA Nisin Z 50–63
LOD 1,7 µg/L Delves Broughton, Friis (1998) Matusaki cùng cộng sự (1995) [15] [41]
Chất chuẩn HPLC Nisin A - LOD µg/L Soliman and Donkor (2010) [54] Sữa, phô mai, Yogurt, Salad, Cà chua đóng hộp, nước uống có cồn Điện di
mao quản Nisin A 83-104
LOD 0,3-0,8 (mg /L) LOQ 1,0-2,8 (mg /L) Standley và cộng sự (2009) Thực phẩm Điện di mao quản Gallidermin, Cinnamycin, 86–99,6 LOD 0,058
[55] Duramycin Nisin A (mg /L) LOQ 0,191 (mg /L) N. Schneider, K.Werkmeister, M. Pischetsrieder (2011) [4] Phomat chế biến