- Khảo sát nồng độ dung dịch đệm chiết CH3COONH4 – NaCl: (0,01 – 0,1M); (0,05 – 0,5M); (0,1 – 1M); (0,2 – 2M); (0,3 – 3M).
- Khảo sát pH dung dịch đệm chiết: pH = 2,0; pH = 2,5; pH = 3,0; pH = 4; pH= 5,0; pH = 6,6.
- Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết: CH3COONH4 0,1M – NaCl 1M / MeOH (1/2; 1/1; 2/1).
- Khảo sát thời gian rung siêu âm : 5 phút; 10 phút; 20 phút; 30 phút. - Khảo sát số lần chiết mẫu: 1 lần; 2 lần; 3 lần.
+ Quy trình 1: Lọc dung dịch chiết bằng giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,22 µm. + Quy trình 2: Làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE C18.
2.2.3. Thẩm định phƣơng pháp:
- Độ đặc hiệu/độ chọn lọc. - Xây dựng đường chuẩn. - Giới hạn phát hiện (LOD). - Giới hạn định lượng (LOQ). - Độ lặp lại.
- Độ thu hồi.
2.2.4. Phân tích hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong một số mẫu sản phẩm dinh dưỡng
- Lấy một số nhóm mẫu tại địa bàn Hà Nội như: sữa lỏng, sữa bột, bơ, phomat…
- Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá kết quả.
2.3. Thiết bị, dụng cụ 2.3.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC –MS/MS được thể hiện ở hình 2.1 bao gồm: hệ thống sắc ký lỏng UHPLC và hệ thống khối phổ Xevo TQ - XS của hãng Waters, hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao có khả năng tăng áp suất tối đa 300psi, có buồng điều nhiệt cột lên tới 1000C, hệ thống bơm mẫu tự động với 2 khay đựng mẫu 60 vị trí, 2 bơm dung môi áp suất cao, tự động loại khí. Hệ thống khối phổ sử dụng bộ ion hóa điện hóa, điện áp tối đa của bộ ion hóa +5kV - (-5kV), nhiệt độ tối đa buồng ion hóa 5000C, điện áp tối đa cho 2 tứ cực là 50V, điện áp tối đa cho bát cực bắn phá ion là 300V. Có khả năng phát hiện các mảnh khối (m/z) từ 2 - 2048 m/z, độ phân giải 1000u/giây. Tốc độ quét 15.000 u/giây, thời gian quét đổi từ ion âm sang ion dương là 15 ms.
Hình 2.1. Hệ thống thiết bị UPLC – MS/MS
- Cột tách sắc ký: Sử dụng cột Acquity BEH C18 (100 x 2,1mm, 1,7 μm (Waters) - Bộ chiết pha rắn SPE, Waters
- Cột chiết pha rắn SPE: Supelco DSC - C18 - Máy lắc vortex, VELP
- Máy xay Philip 600W - Máy ly tâm MIKRO 22R
- Cân phân tích có độ chính xác ± 0,01mg - Cân kỹ thuật có độ chính xác ± 0,01g - Bể rung siêu âm
2.3.2. Dụng cụ
- Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100, 500, 1000 mL - Ống ly tâm 15, 50mL (Đức, Mỹ)
- Ống đong chia vạch các loại: 10, 100, 200 mL (Đức) - Cốc có mỏ dung tích: 50, 100, 200,400, 1000 mL (Đức) - Lọ đựng pha động các loại: 250, 500, 1000, 2000 mL (Đức)
- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200µL; 1000µL; 5mL… đầu côn (Đức) - Đầu tip pipet các loại: 10, 100, 250, and 1000 µL (Đức)
- Màng lọc PTFE 0,22µm (Đức) - Vial loại 1,8 mL (Đức)
- Xylanh 3 mL (Việt Nam)
2.4. Hóa chất, chất chuẩn
Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đều thuộc loại tinh khiết phân tích dùng cho hệ thống thiết bị UHPLC.
2.4.1. Chất chuẩn
- Các chất chuẩn được cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich với độ tinh khiết lần lượt Nisin A (2,5%), Nisin Z (99%).
- Dung dịch chuẩn gốc Nisin A 100mg/L: Cân 40mg Nisin A (2,5%) chính xác đến ± 0,01 mg trên cân phân tích, hòa tan hoàn toàn và định mức đến vạch bằng hỗn hợp acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile vào bình định mức10mL. Dung dịch chuẩn được bảo quản trong các ống nghiệm bằng nhựa polypropylene (PP) 15mL (Eppendoft, Đức) ở nhiệt độ -200C.
- Dung dịch chuẩn gốc Nisin Z 100 mg/L: Cân 1mg Nisin Z (99%) chính xác đến ± 0,01 mg trên cân phân tích, hòa tan hoàn toàn và định mức đến vạch bằng hỗn hợp acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile vào bình định mức10mL. Dung dịch chuẩn được bảo quản trong các ống nghiệm bằng nhựa polypropylene (PP) 15mL (Eppendoft, Đức) ở nhiệt độ -200C.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (10 mg/L): Hút chính xác 1mL từng dung dịch chuẩn gốc Nisin A và Nisin Z (100mg/L) vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng hỗn hợp dung dịch acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile.
- Dung dịch chuẩn làm việc (1000µg/L): Hút chính xác 1mL chuẩn trung gian (10mg/L) vào bình định mức 10mL, pha loãng và định mức đến vạch bằng hỗn hợp acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile. Dung dịch chuẩn được bảo quản trong các ống nghiệm bằng nhựa polypropylene (PP) 15mL (Eppendoft, Đức) ở nhiệt độ -200C.
- Dung dịch chuẩn làm việc trong ngày: Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1000µg/L trong hỗn hợp acid formic 0,5% chứa 20% acetonitrile để thu được các dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ: 5; 10; 20; 50; 100; 250, 500, 1000 µg/L.
2.4.2. Các loại hóa chất, dung môi khác
- Methanol (Merck 99,9%), Acetonitrile (Merck 99,9%), acid formic (Merck 99,9%), acid clohydric (Merck), isopropanol(Merck 99,9%), Acid Triflouroacetic …
- Chuẩn bị pha động để khảo sát là acid formic với các nồng độ là: 0,05%; 0,1%; 0,2%; 0,3% (v/v).
- Dung dịch HCl 3N: Dùng ống đong lấy khoảng 25mL HCl đậm đặc vào bình định mức 100ml có chứa 40ml nước cất 2 lần. Định mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều. - Dung dịch chiết mẫu: Dung dịch đệm acetate 0,1M – NaCl 1M (pH =2,0): Cân
khoảng 15,42g CH3COONH4 và 117,0g NaCl chuyển vào cốc dung tích 2000mL có chứa khoảng 1500 mL nước cất. Trộn đều trên máy khuấy từ cho đến khi tan được hòan tòan. Điều chỉnh pH của dung dịch tới pH = 2,00 ± 0,02 bằng dung dịch acid HCl 3N. Chuyển định lượng dung dịch vào bình định mức 2000mL và định mức đến vạch bằng nước cất.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 2.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
- Thu thập một số mẫu sản phẩm dinh dưỡng trên thị trường. - Số lượng mẫu: 25
- Địa điểm lấy mẫu: Hà Nội
- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên
2.5.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu
* Chuẩn bị mẫu sơ bộ:
Đối với mẫu rắn như bơ, phomat… mỗi mẫu lấy tối thiểu 20 – 50 g, xay nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu hoặc làm tan chảy ở nhiệt độ 60oC, mẫu lỏng lắc đều trước khi phân tích.
Chuẩn bị mẫu:
+ Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu sau khi được đồng nhất, cân những lượng bằng nhau từ 2 - 5g mẫu vào ống fancol 50 mL, mỗi mẫu phân tích lặp lại 2 lần và kèm một mẫu thêm chuẩn.
+ Chuẩn bị mẫu trắng: Là mẫu giống như mẫu phân tích nhưng không có thành phần Nisin A và Nisin Z.
+ Mẫu thêm chuẩn: Bổ sung dung dịch chuẩn hỗn hợp Nisin A và Nisin Z vào mẫu phân tích. Tiến hành như chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn.
* Xử lý mẫu:
Qua tham khảo một số tài liệu [25] [38] [57], quy trình xử lý mẫu dự kiến được khảo sát như hình 2.2.
Quy trình 1: Cân chính xác khoảng 5g 0,01g mẫu đã đồng nhất ở trên vào ống fancol 50mL, thêm 30mL dung dịch đệm CH3COONH4 – NaCl / MeOH (v/v), lắc xoáy trong 1phút. Sau đó rung siêu âm ở nhiệt độ thường. Ly tâm lạnh ở 40C với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy dịch trong vào bình định mức 50mL, phần bã được chiết lặp với 10mL dung dịch đệm CH3COONH40,1M – NaCl 1M (pH = 2,0)/MeOH (1/1 v/v), lắc xoáy 1 phút, đem ly tâm lạnh ở 40C với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10phút. Gộp dịch chiết vào vào bình định mức 50mL và định mức vừa đủ đến vạch. Lọc dịch chiết qua giấy lọc vào bình nón 100mL, sau đó lọc qua màng lọc cỡ 0,22µm rồi bơm vào hệ thống.
Quy trình 2: Tiến hành chiết như quy trình 1 nhưng dịch chiết mẫu sau khi làm sạch qua màng lọc cỡ 0,22µm, tiếp tục được làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE-C18. Trước tiên cột được hoạt hoá lần lượt bằng 3mL MeOH loại tinh khiết phân tích, 3mL nước cất deion, sau đó nạp 6mL mẫu qua cột, tốc độ chảy không quá 2 mL/phút. Khi toàn bộ lượng mẫu đã được nạp xong, loại bỏ tạp chất bằng 6mL Ethanol. Hút khô 1 phút bằng máy hút chân không. Cuối cùng rửa giải bằng 6mL hỗn hợp dung môi IPA –
TFA0,1% (70/30, v/v), tốc độ rửa giải không quá 2mL/phút, lọc qua màng 0,22 µm. Dung dịch thu được phân tích trên UPLC/MS-MS.
Thêm 30mL dung dịch đệm NaCl : MeOH
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến để xác định Nisin A và Nisin Z
2.5.3. Phƣơng pháp phân tích
Nhóm Nisin trong phân tử có chứa các acid amin, phân cực, tích điện dương, khối lượng phân tử lớn việc xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao là rất khó thực hiện để định lượng. Vì chúng chỉ khác nhau ở vị trí acid amin thứ 27, histidin đối với Nisin A và asparagine đối với Nisin Z, thời gian lưu gần giống nhau. Mặt khác hàm lượng Nisin thường rất nhỏ. Do vậy, trong nghiên cứu này đã tiến hành xây dựng phương pháp xác định đồng thời hàm lượng của Nisin A và Nisin Z trong các sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC –MS/MS). Đây là phương pháp hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác cao.
Cân 2 -5 g mẫu/ống ly tâm 50mL
Rung siêu âm
Li tâm 6000 vòng/phút
Chuyển vào bình định mức 50mL
Lọc qua màng lọc 0,22µm
Phân tích trên UPLC-MS/MS
Đồng nhất, lắc voltex
Làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE C18
Phân tích trên UPLC-MS/MS Phân tích trên UPLC-MS/MS
Các điều kiện và thông số của thiết bị LC-MS/MS để định lượng Nisin A, Nisin Z được tham khảo qua một số nghiên cứu đã được công bố [3] [25] [38] [57]. Các thông số cơ bản của phương pháp được khảo sát trên thiết bị sắc ký lỏng hai lần khối phổ Xevo TQ - XS của hãng Waters tại phòng thí nghiệm Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.
Điều kiện bộ phận khối phổ MS: Bộ phận khối phổ MS/MS với các thông số cơ bản sau:
+ Chế độ ion hóa: ion hóa phun điện tử ESI và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển APCI.
+ Các chương trình khảo sát sự phân mảnh chính: SCAN (quét tất cả mảnh phổ được ion hóa), SIM (chọn lọc ion mẹ được ion hóa), MRM (chọn lọc ion con định lượng và định tính). Qua tham khảo một số báo cáo khoa học, việc lựa chọn phổ khối ion mẹ và ion con của hợp chất Nisin A và Nisin Z thường sử dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử, với chế độ bắn phá ion dương (ESI+). Trong nghiên cứu, tiến hành tiêm trực tiếp (không qua cột tách sắc ký) chất chuẩn nồng độ 100µg/L, chế độ scan ion để khảo sát lựa chọn ion mẹ. Sử dụng phần mềm của thiết bị để khảo sát tự động, lựa chọn ion con, điện thế Cone (CV) và năng lượng bắn phá (CE) tối ưu. Sau khi lựa chọn ion mẹ, ion con và các thông số CV, CE, tiến hành khảo sát trên bộ phận sắc ký lỏng cao áp.
Điều kiện bộ phận sắc ký lỏng cao áp UPLC Acquity I với thông số nhƣ sau: Áp
suất tối đa 1000Pa, với 4 kênh dung môi, có thể sử dụng chế độ rửa giải gradient và hệ thống bơm mẫu tự động thể tích tối đa 20µL
Cột tách: Cột tách góp phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách chất cần
xác định, đặc biệt trong nghiên cứu xác định đồng thời nhiều chất thuộc các nhóm chất khác nhau. Lựa chọn cột phân tích phù hợp dựa trên một số tiêu chí sau:
- Có thể tách tốt các chất cần xác định; - Cột phổ biến, dễ mua, chi phí thấp; - Tuổi thọ cột bền;
- Trong nghiên cứu này, cột tách được khảo sát là cột C18 là loại cột tách phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Thông số cột tách như sau: Cột phân tích Waters Acquity BEH C18 (2,1 x 100, 1,7 μm (waters)
Pha động: Sử dụng phổ biến, đơn giản, dung môi thường được sử dụng cho phân tích sắc ký lỏng hai lần khối phổ là: methanol, acetonitril, dung dịch acid formic 0,1% hoặc acid acetic 0,1% trong nước.
2.5.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Thu thập số liệu và tính kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel
- Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê với các đại lượng đặc trưng: hàm lượng trung bình, độ lệch chuẩn (SD), hiệu suất thu hồi H (%), độ lệch chuẩn tương đối RSD% (CV%) [2].
- Phương pháp đánh giá, só sánh. Đánh giá dữ liệu thu được về chuẩn hóa phương pháp theo hướng dẫn của AOAC.
2.5.5. Phƣơng pháp thẩm định: theo quy định của ISO 17025, AOAC
Xác định độ đặc hiệu/chọn lọc của phƣơng pháp
+ Độ đặc hiệu: Là khả năng phát hiện các chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất...Trong phép phân tích định tính đó phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả là phải âm tính khi có mặt các chất có cấu trúc gần giống với chất phân tích. Trong phép phân tích định lượng, là khả năng phát hiện chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố, nhằm hướng đến kết quả chính xác. Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu. Sau khi chuẩn bị mẫu trắng và phân tích trên thiết bị sắc kí, thêm chất chuẩn nồng độ 10µg/L vào mẫu đã chiết và phân tích mẫu này. So sánh sắc kí đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu, chọn lọc.
+ Độ chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất trong một quy trình. Phương pháp trên sử du g kỹ thuâ sắc ký lỏng
khối phổ 2 lần, thưc hiê bắn phá ion mẹ m/z, đi h lươ g theo ion con taọ thành. Đối với các kỹ thuật MS cần đáp ứng được yêu cầu về điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) với 1 ion me và 2 ion thu đươc 4 điểm IP, như vâỵ phương pháp có tính đăc hiêụ đáp ứng đươc yêu cầu của châu Âu 2002/657/EC. Cách tính điểm IP như bảng 2.1. Số điểm IP tối thiểu cần phải đạt là 4.
Bảng 2.1. Yêu cầu về số điểm IP đạt được đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau
Kỹ thuật Số ion Số điểm
IP
GCMS (EI hoặc CI) N n
GCMS (EI và CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4 GCMS (EI hoặc CI) hai
dẫn xuất 2 (dx A) + 2 (dx B) 4
LC-MS N n
GC-MS-MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4
LC-MS-MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4
GC-MS-MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5
LC-MS-MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5
LC-MS-MS-MS 1 ion mẹ, 1 ion con và 2 ion cháu 5,5
HRMS N 2n
GC-MS và LC-MS 2+2 4
GC-MS và HRMS 2+1 4
Xây dựng đƣờng chuẩn
Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (8 điểm), xác định các giá trị tín hiệu y đo được tương ứng với nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, ta có khảo sát đường biểu diễn là một phương trình đường thẳng: y = ax + b.
Trong đó: a là giá trị độ dốc b là giá trị hệ số chặn
Theo quy định của các tổ chức của Mỹ, Canada, châu Âu, tính toán hệ số tương quan sao cho R > 0,995, độ chệch của các điểm trên đường chuẩn sau khi xây dựng đường chuẩn phải nhỏ hơn ±15% và riêng ở nồng độ LOQ < ± 20% .
Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp
Để xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng trong nghiên cứu dùng chuẩn hỗn hợp Nisin A và Nisin Z với nồng độ 2µg/L rồi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thực (cũng là mẫu trắng không chứa chất phân tích) để nồng độ cuối cùng (sau khi qua tất cả các bước xử lý mẫu) thu được ở các mức nồng độ khác nhau (và <2µg/L). Phân tích mẫu lặp lại10 lần, tính giá trị trung bình x , và độ lệch chuẩn SD. Nếu nồng độ dung dịch thử thỏa mãn điều kiện (*) chọn nồng độ đó là giới hạn phát hiện của phương pháp.
LOD = 3 x SD (1) LOQ = 10 x SD (2) 1 n