2.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
- Thu thập một số mẫu sản phẩm dinh dưỡng trên thị trường. - Số lượng mẫu: 25
- Địa điểm lấy mẫu: Hà Nội
- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên
2.5.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu
* Chuẩn bị mẫu sơ bộ:
Đối với mẫu rắn như bơ, phomat… mỗi mẫu lấy tối thiểu 20 – 50 g, xay nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu hoặc làm tan chảy ở nhiệt độ 60oC, mẫu lỏng lắc đều trước khi phân tích.
Chuẩn bị mẫu:
+ Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu sau khi được đồng nhất, cân những lượng bằng nhau từ 2 - 5g mẫu vào ống fancol 50 mL, mỗi mẫu phân tích lặp lại 2 lần và kèm một mẫu thêm chuẩn.
+ Chuẩn bị mẫu trắng: Là mẫu giống như mẫu phân tích nhưng không có thành phần Nisin A và Nisin Z.
+ Mẫu thêm chuẩn: Bổ sung dung dịch chuẩn hỗn hợp Nisin A và Nisin Z vào mẫu phân tích. Tiến hành như chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn.
* Xử lý mẫu:
Qua tham khảo một số tài liệu [25] [38] [57], quy trình xử lý mẫu dự kiến được khảo sát như hình 2.2.
Quy trình 1: Cân chính xác khoảng 5g 0,01g mẫu đã đồng nhất ở trên vào ống fancol 50mL, thêm 30mL dung dịch đệm CH3COONH4 – NaCl / MeOH (v/v), lắc xoáy trong 1phút. Sau đó rung siêu âm ở nhiệt độ thường. Ly tâm lạnh ở 40C với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy dịch trong vào bình định mức 50mL, phần bã được chiết lặp với 10mL dung dịch đệm CH3COONH40,1M – NaCl 1M (pH = 2,0)/MeOH (1/1 v/v), lắc xoáy 1 phút, đem ly tâm lạnh ở 40C với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10phút. Gộp dịch chiết vào vào bình định mức 50mL và định mức vừa đủ đến vạch. Lọc dịch chiết qua giấy lọc vào bình nón 100mL, sau đó lọc qua màng lọc cỡ 0,22µm rồi bơm vào hệ thống.
Quy trình 2: Tiến hành chiết như quy trình 1 nhưng dịch chiết mẫu sau khi làm sạch qua màng lọc cỡ 0,22µm, tiếp tục được làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE-C18. Trước tiên cột được hoạt hoá lần lượt bằng 3mL MeOH loại tinh khiết phân tích, 3mL nước cất deion, sau đó nạp 6mL mẫu qua cột, tốc độ chảy không quá 2 mL/phút. Khi toàn bộ lượng mẫu đã được nạp xong, loại bỏ tạp chất bằng 6mL Ethanol. Hút khô 1 phút bằng máy hút chân không. Cuối cùng rửa giải bằng 6mL hỗn hợp dung môi IPA –
TFA0,1% (70/30, v/v), tốc độ rửa giải không quá 2mL/phút, lọc qua màng 0,22 µm. Dung dịch thu được phân tích trên UPLC/MS-MS.
Thêm 30mL dung dịch đệm NaCl : MeOH
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến để xác định Nisin A và Nisin Z
2.5.3. Phƣơng pháp phân tích
Nhóm Nisin trong phân tử có chứa các acid amin, phân cực, tích điện dương, khối lượng phân tử lớn việc xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao là rất khó thực hiện để định lượng. Vì chúng chỉ khác nhau ở vị trí acid amin thứ 27, histidin đối với Nisin A và asparagine đối với Nisin Z, thời gian lưu gần giống nhau. Mặt khác hàm lượng Nisin thường rất nhỏ. Do vậy, trong nghiên cứu này đã tiến hành xây dựng phương pháp xác định đồng thời hàm lượng của Nisin A và Nisin Z trong các sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC –MS/MS). Đây là phương pháp hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác cao.
Cân 2 -5 g mẫu/ống ly tâm 50mL
Rung siêu âm
Li tâm 6000 vòng/phút
Chuyển vào bình định mức 50mL
Lọc qua màng lọc 0,22µm
Phân tích trên UPLC-MS/MS
Đồng nhất, lắc voltex
Làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE C18
Phân tích trên UPLC-MS/MS Phân tích trên UPLC-MS/MS
Các điều kiện và thông số của thiết bị LC-MS/MS để định lượng Nisin A, Nisin Z được tham khảo qua một số nghiên cứu đã được công bố [3] [25] [38] [57]. Các thông số cơ bản của phương pháp được khảo sát trên thiết bị sắc ký lỏng hai lần khối phổ Xevo TQ - XS của hãng Waters tại phòng thí nghiệm Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.
Điều kiện bộ phận khối phổ MS: Bộ phận khối phổ MS/MS với các thông số cơ bản sau:
+ Chế độ ion hóa: ion hóa phun điện tử ESI và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển APCI.
+ Các chương trình khảo sát sự phân mảnh chính: SCAN (quét tất cả mảnh phổ được ion hóa), SIM (chọn lọc ion mẹ được ion hóa), MRM (chọn lọc ion con định lượng và định tính). Qua tham khảo một số báo cáo khoa học, việc lựa chọn phổ khối ion mẹ và ion con của hợp chất Nisin A và Nisin Z thường sử dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử, với chế độ bắn phá ion dương (ESI+). Trong nghiên cứu, tiến hành tiêm trực tiếp (không qua cột tách sắc ký) chất chuẩn nồng độ 100µg/L, chế độ scan ion để khảo sát lựa chọn ion mẹ. Sử dụng phần mềm của thiết bị để khảo sát tự động, lựa chọn ion con, điện thế Cone (CV) và năng lượng bắn phá (CE) tối ưu. Sau khi lựa chọn ion mẹ, ion con và các thông số CV, CE, tiến hành khảo sát trên bộ phận sắc ký lỏng cao áp.
Điều kiện bộ phận sắc ký lỏng cao áp UPLC Acquity I với thông số nhƣ sau: Áp
suất tối đa 1000Pa, với 4 kênh dung môi, có thể sử dụng chế độ rửa giải gradient và hệ thống bơm mẫu tự động thể tích tối đa 20µL
Cột tách: Cột tách góp phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách chất cần
xác định, đặc biệt trong nghiên cứu xác định đồng thời nhiều chất thuộc các nhóm chất khác nhau. Lựa chọn cột phân tích phù hợp dựa trên một số tiêu chí sau:
- Có thể tách tốt các chất cần xác định; - Cột phổ biến, dễ mua, chi phí thấp; - Tuổi thọ cột bền;
- Trong nghiên cứu này, cột tách được khảo sát là cột C18 là loại cột tách phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Thông số cột tách như sau: Cột phân tích Waters Acquity BEH C18 (2,1 x 100, 1,7 μm (waters)
Pha động: Sử dụng phổ biến, đơn giản, dung môi thường được sử dụng cho phân tích sắc ký lỏng hai lần khối phổ là: methanol, acetonitril, dung dịch acid formic 0,1% hoặc acid acetic 0,1% trong nước.
2.5.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Thu thập số liệu và tính kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel
- Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê với các đại lượng đặc trưng: hàm lượng trung bình, độ lệch chuẩn (SD), hiệu suất thu hồi H (%), độ lệch chuẩn tương đối RSD% (CV%) [2].
- Phương pháp đánh giá, só sánh. Đánh giá dữ liệu thu được về chuẩn hóa phương pháp theo hướng dẫn của AOAC.
2.5.5. Phƣơng pháp thẩm định: theo quy định của ISO 17025, AOAC
Xác định độ đặc hiệu/chọn lọc của phƣơng pháp
+ Độ đặc hiệu: Là khả năng phát hiện các chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất...Trong phép phân tích định tính đó phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả là phải âm tính khi có mặt các chất có cấu trúc gần giống với chất phân tích. Trong phép phân tích định lượng, là khả năng phát hiện chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố, nhằm hướng đến kết quả chính xác. Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu. Sau khi chuẩn bị mẫu trắng và phân tích trên thiết bị sắc kí, thêm chất chuẩn nồng độ 10µg/L vào mẫu đã chiết và phân tích mẫu này. So sánh sắc kí đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu, chọn lọc.
+ Độ chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất trong một quy trình. Phương pháp trên sử du g kỹ thuâ sắc ký lỏng
khối phổ 2 lần, thưc hiê bắn phá ion mẹ m/z, đi h lươ g theo ion con taọ thành. Đối với các kỹ thuật MS cần đáp ứng được yêu cầu về điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) với 1 ion me và 2 ion thu đươc 4 điểm IP, như vâỵ phương pháp có tính đăc hiêụ đáp ứng đươc yêu cầu của châu Âu 2002/657/EC. Cách tính điểm IP như bảng 2.1. Số điểm IP tối thiểu cần phải đạt là 4.
Bảng 2.1. Yêu cầu về số điểm IP đạt được đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau
Kỹ thuật Số ion Số điểm
IP
GCMS (EI hoặc CI) N n
GCMS (EI và CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4 GCMS (EI hoặc CI) hai
dẫn xuất 2 (dx A) + 2 (dx B) 4
LC-MS N n
GC-MS-MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4
LC-MS-MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4
GC-MS-MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5
LC-MS-MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5
LC-MS-MS-MS 1 ion mẹ, 1 ion con và 2 ion cháu 5,5
HRMS N 2n
GC-MS và LC-MS 2+2 4
GC-MS và HRMS 2+1 4
Xây dựng đƣờng chuẩn
Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (8 điểm), xác định các giá trị tín hiệu y đo được tương ứng với nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, ta có khảo sát đường biểu diễn là một phương trình đường thẳng: y = ax + b.
Trong đó: a là giá trị độ dốc b là giá trị hệ số chặn
Theo quy định của các tổ chức của Mỹ, Canada, châu Âu, tính toán hệ số tương quan sao cho R > 0,995, độ chệch của các điểm trên đường chuẩn sau khi xây dựng đường chuẩn phải nhỏ hơn ±15% và riêng ở nồng độ LOQ < ± 20% .
Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp
Để xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng trong nghiên cứu dùng chuẩn hỗn hợp Nisin A và Nisin Z với nồng độ 2µg/L rồi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thực (cũng là mẫu trắng không chứa chất phân tích) để nồng độ cuối cùng (sau khi qua tất cả các bước xử lý mẫu) thu được ở các mức nồng độ khác nhau (và <2µg/L). Phân tích mẫu lặp lại10 lần, tính giá trị trung bình x , và độ lệch chuẩn SD. Nếu nồng độ dung dịch thử thỏa mãn điều kiện (*) chọn nồng độ đó là giới hạn phát hiện của phương pháp.
LOD = 3 x SD (1) LOQ = 10 x SD (2) 1 n ) x x ( SD 2 i (3) Đánh giá LOD đã tính được: tính R = x / LOD (*)
Nếu 4 ≤ R ≤ 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy.
Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một lượng chất chuẩn nhất định vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.
Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.
Xác định độ lặp lại (đánh giá độ chụm):
Phân tích mẫu thêm chuẩn lặp lại 6 lần. Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD (%) tính được so với RSD (%) cho phép ở nồng độ chất tương ứng theo AOAC (phụ lục A1).
(45) Trong đó:
xi : là giá trị đo được thứ i
X : là giá trị trung bình n : là số lần đo.
SDr: Độ lệch chuẩn lặp lại
RSDr: Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại
Xác định độ thu hồi của phƣơng pháp (độ đúng)
Xác định trên mẫu thực không chứa chất phân tích. Thêm một lượng chất chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau vào mẫu thử, phân tích lặp lại 3 lần các mẫu thêm chuẩn đó, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:
100 C C C % R c m c m (55) Trong đó: R%: Độ thu hồi, %
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc: Nồng độ chuẩn (lý thuyết)
Yêu cầu: Độ đúng được phản ánh qua tỷ lệ phần trăm giữa kết quả định lượng so với hoạt chất cho vào. Theo AOAC, lượng chuẩn tìm lại nằm trong khoảng 60 – 120% với hàm lượng hoạt chất trong mẫu từ 10ppb tới nhỏ hơn 100ppb (phụ lục A2).
2.5.6. Phƣơng pháp định lƣợng
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS:
* Phân tích định tính: Dựa vào thời gian lưu của chất phân tích, kết hợp với so sánh phổ khối đặc trưng và cường độ vạch phổ của chất chuẩn hoặc chất phân tích với thư viện phổ.
X SD
RSD 100
* Phân tích định lượng: Sử dụng phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn để định lượng chất cần phân tích trong mẫu, đồng thời kiểm soát sự thu hồi của phương pháp phân tích.
Hàm lượng Nisin A hoặc Nisin Z trong mẫu được tính theo công thức sau:.
(6) Trong đó:
X: Hàm lượng Nisin trong mẫu (mg/kg, mg/L) V: thể tích định mức (mL)
K: hệ số pha loãng
C: nồng độ Nisin tính theo đường chuẩn (g/mL) m: Khối lượng của mẫu phân tích (g, mL)
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu hóa điều kiện phân tích Nisin A và Nisin Z trên thiết bị LC-MS/MS 3.1.1. Tối ƣu các thông số của detector (MS/MS) 3.1.1. Tối ƣu các thông số của detector (MS/MS)
Trong công thức cấu tạo của Nisin A và Nisin Z có chứa nhiều nhóm amin, các nhóm này dễ nhận proton H+ trong môi trường acid để hình thành ion [M+5H]5+, [M+4H]4+, [M+3H]3+, qua tham khảo một số tài liệu [3] [25] [38] [57], do vậy trong nghiên cứu này tiến hành khảo sát xác định Nisin A và Nisin Z bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dương (ESI +). Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion mẹ có dạng [M+5H]5+
. Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ tiến hành tiêm 10µL dung dịch chuẩn Nisin A và Nisin Z sử dụng dung dịch chuẩn đơn nồng độ 100µg/L trực tiếp (không qua cột tách) vào bộ phận khối phổ chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất Nisin A và Nisin Z để lựa chọn ion mẹ, ion con dùng để định lượng và định tính đối với từng chất.
Các thông số cơ bản được cài đặt như sau: Thể tích tiêm mẫu: 10µL
Chế độ quan sát: SCAN Kỹ thuật ion hóa: ESI +
Nhiệt độ buồng ion hóa: 3000C Tốc độ dòng khí N2: 10L/phút
Điện áp mao quản: 2000V (Negative) Nebulizer: 40psi
Thời gian scan: 500ms
Từ kết quả thu được khi khảo sát xác định ion mẹ (precusor ion) với các thông số nguồn và khí trên, khảo sát điện thế Cone (CV) từ 50 – 140V, năng lượng bắn phá
ion (CE) từ 0 – 40eV, điều kiện phân mảnh của từng chất được tối ưu hóa tự động để lựa chọn ion con (product ion). Hai ion con được lựa chọn cho mỗi chất, ion con có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng và ion có cường độ thấp hơn dùng để xác nhận, các kết quả được trình bày như trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh
Tên chất phân tích Chế độ ion hóa Khối lƣợng phân tử (Da) Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) Điện thế Cone (V) Năng lƣợng phân mảnh (eV) Nisin A ESI + 3358,53 671,6 809,7* 46 14 ESI + 671,6 788,9 46 14 Nisin Z ESI + 3335,91 667,0 805,3* 40 14 ESI + 667,0 738,9 40 16 Ghi chú: mảnh (*) là mảnh định lượng
3.1.2. Tối ƣu hóa các điều kiện của sắc kí lỏng 3.1.2.1. Pha tĩnh
Cột tách có vai trò quan trọng trong việc tách các chất khỏi nhau. Tùy thuộc vào bản chất và thành phần mẫu hoặc các đặc tính của cấu tử mà lựa chọn kiểu cột tách, pha tĩnh, kích thước cột, chiều dài cột tách phù hợp. Kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo sử dụng cột tách C18 rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm Việt Nam hiện nay. Cột C18 có khả năng phân tách tốt đối với các chất từ phân cực đến ít phân cực. Nisin là chất có phân cực, có khả năng tan tốt trong nước, qua tham khảo một số tài liệu [3] [25] [38] [57], phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, trong nghiên cứu này đã lựa chọn cột tách sắc ký C18 với các thông số cột như sau:
- Loại cột: Acquity BEH C18 hãng Waters thông số cột (100 x 2,1mm; 1,7 µm). Cột Acquity BEH chịu được pH trong khoảng 1 – 12, nhiệt độ đến 600C và tương thích