3.1.1. Tối ƣu các thông số của detector (MS/MS)
Trong công thức cấu tạo của Nisin A và Nisin Z có chứa nhiều nhóm amin, các nhóm này dễ nhận proton H+ trong môi trường acid để hình thành ion [M+5H]5+, [M+4H]4+, [M+3H]3+, qua tham khảo một số tài liệu [3] [25] [38] [57], do vậy trong nghiên cứu này tiến hành khảo sát xác định Nisin A và Nisin Z bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dương (ESI +). Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion mẹ có dạng [M+5H]5+
. Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ tiến hành tiêm 10µL dung dịch chuẩn Nisin A và Nisin Z sử dụng dung dịch chuẩn đơn nồng độ 100µg/L trực tiếp (không qua cột tách) vào bộ phận khối phổ chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất Nisin A và Nisin Z để lựa chọn ion mẹ, ion con dùng để định lượng và định tính đối với từng chất.
Các thông số cơ bản được cài đặt như sau: Thể tích tiêm mẫu: 10µL
Chế độ quan sát: SCAN Kỹ thuật ion hóa: ESI +
Nhiệt độ buồng ion hóa: 3000C Tốc độ dòng khí N2: 10L/phút
Điện áp mao quản: 2000V (Negative) Nebulizer: 40psi
Thời gian scan: 500ms
Từ kết quả thu được khi khảo sát xác định ion mẹ (precusor ion) với các thông số nguồn và khí trên, khảo sát điện thế Cone (CV) từ 50 – 140V, năng lượng bắn phá
ion (CE) từ 0 – 40eV, điều kiện phân mảnh của từng chất được tối ưu hóa tự động để lựa chọn ion con (product ion). Hai ion con được lựa chọn cho mỗi chất, ion con có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng và ion có cường độ thấp hơn dùng để xác nhận, các kết quả được trình bày như trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh
Tên chất phân tích Chế độ ion hóa Khối lƣợng phân tử (Da) Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) Điện thế Cone (V) Năng lƣợng phân mảnh (eV) Nisin A ESI + 3358,53 671,6 809,7* 46 14 ESI + 671,6 788,9 46 14 Nisin Z ESI + 3335,91 667,0 805,3* 40 14 ESI + 667,0 738,9 40 16 Ghi chú: mảnh (*) là mảnh định lượng
3.1.2. Tối ƣu hóa các điều kiện của sắc kí lỏng 3.1.2.1. Pha tĩnh
Cột tách có vai trò quan trọng trong việc tách các chất khỏi nhau. Tùy thuộc vào bản chất và thành phần mẫu hoặc các đặc tính của cấu tử mà lựa chọn kiểu cột tách, pha tĩnh, kích thước cột, chiều dài cột tách phù hợp. Kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo sử dụng cột tách C18 rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm Việt Nam hiện nay. Cột C18 có khả năng phân tách tốt đối với các chất từ phân cực đến ít phân cực. Nisin là chất có phân cực, có khả năng tan tốt trong nước, qua tham khảo một số tài liệu [3] [25] [38] [57], phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, trong nghiên cứu này đã lựa chọn cột tách sắc ký C18 với các thông số cột như sau:
- Loại cột: Acquity BEH C18 hãng Waters thông số cột (100 x 2,1mm; 1,7 µm). Cột Acquity BEH chịu được pH trong khoảng 1 – 12, nhiệt độ đến 600C và tương thích với pha động chứa 0 – 100% dung dịch nước hoặc dung môi hữu cơ.
3.1.2.2. Thành phần pha động
Pha động trong HPLC là hệ dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký. Pha động không chỉ ảnh hưởng đến quá trình tách các chất mà còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kỹ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid formic, amoni acetate...Trong nghiên cứu này tiến hành khảo sát hai hệ pha động với pha động 1: acetonitrile (B)/ acid formic 0,1% (A); pha động 2: acetonitrile chứa TFA 0,05%(B)/TFA 0,05% (A). Tiến hành: Bơm cùng 1 nồng độ chất chuẩn Nisin A và Nisin Z 100 µg/L, chạy chế độ đẳng dòng, tỷ lệ B/A là 85/15, tốc độ dòng là 0,15 mL/phút. Kết quả: Cả 2 thành phần pha động này đều có thể sử dụng làm pha động để phân tích Nisin A và Nisin Z (đều đẩy được Nisin A và Nisin Z ra khỏi cột, sắc đồ phổ khối gồm ion mẹ và 02 ion con điển hình của Nisin A và Nisin Z). Tuy nhiên nhược điểm của thành phần pha động sử dụng TFA có chứa gốc muối nên nhanh làm bẩn cone của nguồn, ảnh hưởng đến tín hiệu chất phân tích. Hỗn hợp hai dung môi gồm acid formic và acetonitrile được sử dụng phổ biến trong phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ. Tất cả các thành phần pha động là chất dễ bay hơi, không chứa các gốc muối. Do đó, tần xuất làm sạch nguồn ion hóa trong phân tích được giảm thiểu tối đa và theo tham khảo một số tài liệu [25] [38] [57], trong nghiên cứu này đã lựa chọn pha động là acetonitrile/ nước – acid formic 0,1% cho các khảo sát tiếp theo. Sau khi lựa chọn được dung môi pha động, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách sắc ký bao gồm nồng độ pha động, tỉ lệ thành phần dung môi trong pha động, các yếu tố này sẽ ảnh hưởng đến khả năng lưu giữ, độ phân giải chất phân tích trên cột khác nhau.
3.1.2.3. Khảo sát nồng độ acid formic trong pha động
Dựa vào cơ chế phân mảnh ion và tham khảo một số tài liệu [25] [38] [57], nhận thấy tín hiệu của Nisin A và Nisin Z bị ảnh hưởng bởi nồng độ acid formic trong pha động. Trong nghiên cứu, tiến hành khảo sát nồng độ acid formic trong pha động bằng việc thay đổi nồng độ acid formic với các giá trị: 0,0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3(%) để tăng nồng độ H+ trong môi trường. Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp 20µg/L để khảo sát dung môi pha động. Hơn nữa để có thể vừa tách được các chất, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, tiến hành rửa giải với chế độ gradient. Điều kiện phân tích trên thiết bị LC- MS/MS được cố định như sau :
- Cột C18 (100 x 2 mm, 1,7 μm)
- Pha động: kênh B cố định: ACN, kênh A: HCOOH 0%, HCOOH 0,1%, HCOOH 0,2%, HCOOH 0,3%.
- Tốc độ dòng: 0,15mL/phút
- Hệ thống MS/MS được cài đặt theo các điều kiện được tối ưu ở phần 3.1. - Chương trình gradient như bảng 3.2
Bảng 3.2. Chương trình gradient được lựa chọn
Thời gian (phút) Tỷ lệ (%) kênh B
0 – 1 10
1,01 – 3 50
3,01 – 4 80
4,01 – 6 10
6,01 – 8 10
Hình 3.1. Ảnh hưởng nồng độ acid formic
Từ đồ thị trên hình 3.1 cho thấy, tín hiệu các chất phân tích bị ảnh hưởng khá nhiều bởi nồng độ acid formic trong pha động. Khi nồng độ acid formic thấp thì tín hiệu chất phân tích thấp và ngược lại khi nồng độ acid formic tăng thì tín hiệu chất phân tích tăng, tuy nhiên khi nồng độ acid formic tăng quá cao dẫn đến hiện tượng cạnh tranh ion làm tín hiệu chất phân tích giảm. Tín hiệu đạt giá trị độ nhạy cao nhất khi nồng độ acid formic là 0,1%. Do đó, nồng độ acid formic 0,1% được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.2.4. Khảo sát chƣơng trình rửa giải gradient
Nisin A và Nisin Z là hai hợp chất trong cùng một nhóm, có cấu trúc gần giống nhau, vì vậy việc sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng (isocractic) là không phù hợp để phân tích Nisin A, Z. Để có thể vừa tách được các chất, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, qua tham khảo tài liệu [3] [25] [38] [57], tiến hành khảo sát chương trình rửa giải gradient theo bảng 3.3 với các điều kiện cố định như sau:
- Cột C18 (100 x 2 mm, 1,7 μm)
- Pha động: kênh A (acid formic 0,1%), kênh B: ACN - Tốc độ dòng: 0,15mL/phút
- Hệ thống LC-MS/MS được cài đặt theo các điều kiện được tối ưu ở phần 3.1. Kết quả phân tích được chỉ ra trong hình 3.2 – 3.4.
Bảng 3.3. Chương trình rửa giải gradient Chương trình gradient Thời gian (phút) Tốc độ dòng (mL/phút) Kênh A Acid formic 0,1% Kênh B ACN Gradient 1 0 – 1 0,15 100 0 1,01 - 5 0,15 30 70 5,01 - 8 0,15 80 20 8,01 - 10 0,15 100 0 Gradient 2 0 – 2 0,15 90 10 2,01 - 6 0,15 30 70 6,01 – 10 0,15 90 10 Gradient 3 0 – 1 0,15 90 10 1,01 - 3 0,15 50 50 3,01-6 0,15 20 80 6,01- 8 0,15 90 10
Khi tăng nồng độ kênh dung môi hữu cơ (kênh B) chất phân tích ra khỏi cột nhanh hơn. Ban đầu dung môi chủ yếu là nước (90%) để nhóm Nisin tương tác với cột đồng thời ổn định vị trí phân bố trên cột, khi đã phân bố ổn định rồi, để quá trình tách sắc kí xảy ra, tăng lượng dung môi lên một cách từ từ (10 – 80% trong 4 phút) sau đó duy trì dung môi ACN ở 80% đẩy nhanh chất ra khỏi cột đồng thời làm sạch cột, cuối cùng duy trì tỉ lệ pha động bằng với nồng độ ban đầu để ổn định cột cho lần bơm tiếp theo, đảm bảo các lần bơm cột đều ổn định như nhau. Nisin A và Nisin Z có ái lực gần như giống nhau đối với pha tĩnh và pha động, do vậy thời gian lưu rất gần nhau. Khi giữ tỷ lệ ACN quá ít hoặc quá nhiều đều làm píc doãng, chân píc bị kéo đuôi, làm giảm độ nhạy của phương pháp. Qua quá trình khảo sát cho thấy, chế độ rửa giải gradient 3 cho tín hiệu pic đẹp nhất, pic thu được không bị tù, không kéo đuôi và tín hiệu pic cũng cao nhất. Do đó, trong nghiên cứu này lựa chọn chương trình rửa giải gradient 3 và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.2. Sắc đồ chương trình gradient 1
Hình 3.3. Sắc đồ chương trình gradient 2
Hình 3.4. Sắc đồ chương trình gradient 3
Tóm lại: Trên cơ sở kết quả khảo sát trên, thu được các thông số tối ưu cho quá trình tách, định lượng Nisin A và Nisin Z trên thiết bị LC-MS/MS theo bảng 3.4.
TT Điều kiện Thông số A. Sắc ký lỏng LC
1 Cột tách Cột C18 (100 x 2 mm; 1,7 μm)
2 Nhiệt độ cột 40oC
3 Thể tích tiêm mẫu 10μL
4 Pha động Kênh A (acid formic 0,1%), Kênh B: ACN
5 Tốc độ dòng 0,15mL/phút
6 Chương trình gradient Chương trình 3 7 Thời gian phân tích 8 phút
B. Khối phổ
1 Chế độ quan sát MRM
2 Kỹ thuật ion hóa ESI +
3 Nhiệt độ buồng ion hóa 300oC 4 Tốc độ dòng khí N2 10 L/phút 5 Điện áp mao quản 2000V (Negative) 6 Áp suất dòng phun Nebulizer 40 psi 7 Ion đặc trưng, thế phân mảnh và năng lượng bắn phá Nisin A 671,6 →809,7* (CV 40V, CE 14eV) Nisin Z 667,6 →805,3* (CV 40V, CE 14eV) Chú thích: ion (*) là ion định lượng
3.2. Khảo sát quá trình xử lý mẫu
Quy trình phân tích Nisin A và Nisin Z trong nước và trên thế giới đã được nghiên cứu và công bố [15] [25] [38] [57] [58] [60], mỗi tác giả đưa ra những điều kiện xử lý mẫu, nền mẫu khác nhau, dẫn đến hiệu suất thu hồi khác nhau, giới hạn định lượng và định tính khác nhau. Trên cơ sở các quy trình phân tích Nisin A và Nisin Z trong nước cũng như trên thế giới đã được nghiên cứu, trong nghiên cứu này đã tiến
hành khảo sát lại một số bước cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm như sau:Sử dụng một nền mẫu thực phẩm dinh dưỡng dạng lỏng để khảo sát một số điều kiện chiết mẫu gồm: nồng độ dung dịch đệm, pH dung dịch đệm, tỷ lệ giữa dung dịch đệm và MeOH, quy trình làm sạch…
3.2.1. Khảo sát nồng độ dung dịch amoni acetate - NaCl trong dung môi chiết
Sử dụng nền mẫu sữa lỏng không phát hiện Nisin A và Nisin Z. Sau khi cân mẫu, thêm hỗn hợp chuẩn Nisin để thu được nồng độ 10µg/L trong dịch chiết cuối cùng trước khi bơm vào thiết bị LC-MS/MS. Để yên 5 phút. Tiến hành chiết với nồng độ đệm amoni acetat – NaCl như sau: 0,01 - 0,1; 0,05 – 0,5; 0,1 – 1; 0,2 – 2; 0,4 - 4M /MeOH (1/1). Tại mỗi nồng độ làm lặp hai mẫu. Tính toán theo công thức (5), kết quả thu được trong hình 3.5.
Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chiết mẫu
Kết quả phân tích cho thấy khi thay đổi nồng độ dung dịch 0,05-0,5 đến 0,4 – 4M lượng chất phân tích thu được tăng dần và cao nhất tại nồng độ dung dịch đệm 0,1M – 1M. Tuy nhiên, khi nồng độ tăng quá cao, lượng chất phân tích thu được giảm xuống. Cũng giống như việc khảo sát nồng độ acid formic trong pha động, khi nồng độ muối cao, nồng độ các ion trong mẫu cao, lượng ion đi vào buồng ion tăng, cạnh tranh
với ion của chất phân tích làm giảm tín hiệu của chất phân tích và làm buồng ion hóa bị nhiễm bẩn và ảnh hưởng đến hệ thống UPLC, giảm tuối thọ của cột phân tích. Do đó, trong nghiên cứu này hệ đệm CH3COONH4 - NaCl nồng độ 0,1 - 1M đã được lựa chọn để chiết mẫu và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Lựa chọn pH trong dung dịch đệm
Việc lựa chọn pH của dung dịch đệm chiết là rất quan trọng. Ở môi trường pH khác nhau trạng thái tồn tại của các Nisin là khác nhau, do đó sẽ ảnh hưởng đến việc hòa tan được chất phân tích trong mẫu. Dựa vào tính chất của Nisin và tham khảo một số tài liệu [25] [38] [40] [57], cho thấy khi pH của mẫu ở môi trường pH = 2,0 thì sự hòa tan của Nisin A và Nisin Z là tốt nhất, nên trong nghiên cứu này tiến hành khảo sát các giá trị pH từ 2,0 đến 6,6. Sử dụng nền mẫu sữa lỏng tương tự như trên không có chứa Nisin A và Nisin Z. Sau khi cân mẫu, thêm chuẩn hỗn hợp Nisin A và Nisin Z để thu được nồng độ 10µg/L trong dịch chiết cuối cùng trước khi bơm vào thiết bị LC- MS/MS. Để yên 5 phút. Tiến hành chiết mẫu theo quy trình với các giá trị pH như sau: pH = 2,0; pH = 2,5; pH = 3,0, pH = 4,0; pH = 5,0; pH = 6,6 với quy trình chiết như trên. Tính toán theo công thức (5), kết quả thu được trong hình 3.6.
Từ kết quả ở đồ thị hình 3.6 ta thấy, khi chiết ở pH = 2,0 hiệu suất Nisin thu được là cao nhất, hiệu suất giảm dần khi pH tăng dần. Dựa trên tính chất của Nisin hoà tan tốt nhất trong môi trường acid và ổn định nhất ở pH = 2,0. Cho thấy, kết quả của thực nghiệm phù hợp với tính chất của Nisin. Vì vậy, trong nghiên cứu đã lựa chọn pH = 2,0 để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết
Nền mẫu thực phẩm dinh dưỡng như sữa, bơ, phomat có chứa rất nhiều chất béo, protein, các chất nhũ hóa…. Nếu thành phần của dung môi chiết chỉ là hỗn hợp dung dịch đệm CH3COONH40,1M – NaCl1M (pH = 2,0) thì hiệu suất thu hồi của Nisin A và Nisin Z bị ảnh hưởng. Việc thêm dung môi MeOH vào thành phần dung dịch chiết làm tăng hiệu suất chiết của Nisin A và Nisin Z. Do đó, trong nghiên cứu này tiến hành khảo sát tỷ lệ dung dịch đệm và dung môi MeOH. Sử dụng nền mẫu sữa lỏng không phát hiện Nisin A và Nisin Z. Sau khi cân mẫu, thêm chuẩn hỗn hợp Nisin để thu được nồng độ 20µg/L trong dịch chiết cuối cùng trước khi bơm vào máy LC – MS/MS. Để yên 5 phút, tiến hành chiết theo quy trình đã tối ưu ở trên với tỉ lệ dung dịch CH3COONH40,1M – NaCl1M (pH 2) /MeOH lần lượt là: 2/1; 1/2; 1/1. Tại mỗi nồng độ làm lặp hai mẫu. Tính toán theo công thức (5), thu được kết quả như hình 3.7.
Từ kết quả ở đồ thị hình 3.7 cho thấy, tại tỷ lệ chiết 1/1 cho hiệu suất thu hồi lớn nhất. Khi tăng thể tích MeOH ta thấy hiệu suất thu hồi của Nisin Z giảm đáng kể. Khi