Chƣơng 2 : THỰC NGHIỆM
2.4. Dụng cụ và hóa chất
2.4.1. Dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L-2000 với detector UV-Vis L-2420 của Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.
- Máy quang phổ UV – 1700 Shimadzu của Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm – 900 nm, có kết nối máy tính.
- Bộ cuvet thạch anh.
- Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g. - Máy rung siêu âm và máy đo pH.
- Chương trình lọc Kalman tính tốn đồng thời nồng độ các cấu tử [23]. - Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm...
- Bình định mức dung dịch: 10 mL; 25 mL; 50 mL; 100 mL; 1000mL. - Pipet các loại: 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; 25 mL.
- Màng lọc 0,45µm và một số dụng cụ khác.
2.4.2. Hóa chất
HCl, H2SO4, HNO3, H3PO4, Na2HPO4 dạng tinh thể,CH3CN, axetonitril... dùng để pha chế các dung dịch đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
Paracetamol chuẩn của merck độ tinh khiết > 97,5%
Ibuprofen chuẩn của merck độ tinh khiết > 98,8%
Dung dịch axetonitril của merck, dung dịch H3PO4 đặc.
Thuốc Dibulaxan do công ty cổ phần dược Danapah sản xuất, có thành phần paracetamol 325mg và ibuprofen 200mg. Số lô 050719, ngày sản xuất 10/08/2019, hạn sử dụng 10/08/2022
Thuốc Ibucapvic do công ty cổ phần dược phẩm trung ương Mediplatex sản xuất có thành phần paracetamol 325mg và ibuprofen 200mg. Số lô 204420, ngày sản xuất 18/01/2020, hạn sử dụng 17/01/2023
Thuốc Travicol do công ty cổ phần dược TV Pharma (Việt Nam) sản xuất, có thành phần paracetamol 500mg và ibuprofen 200mg. Số lơ 041717, ngày sản xuất 15/01/2017, hạn sử dụng 14/01/2020.
2.5. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Dung mơi pha mẫu
- Cân chính xác 3,5598g Na2HPO4 vào bình 1 lít, sau đó định mức thành 1000 mL bằng nước cất 2 lần. Dùng máy pH điều chỉnh pH = 6 bằng axit H3PO4 đặc nồng độ 85 % ta được dung dịch đệm phosphat có pH = 6.
Dung dịch chuẩn gốc:
- Dung dịch paracetamol chuẩn: Cân chính xác 0,100 g paracetamol cho vào bình định mức 100 mL sau đó cho thêm vào dung môi pha mẫu, rung siêu âm và định mức đến 100 mL. Ta được dung dịch vitamin B1 có nồng độ 1000 (ppm). Từ dung dịch này ta pha loãng ra các nồng độ 200 (ppm); 400 (ppm); 600 (ppm); 800 (ppm);
- Dung dịch B6 chuẩn: Cân chính xác 0,100 g ibuprofen cho vào bình định mức 100 mL sau đó cho thêm vào dung môi pha mẫu, rung siêu âm và định mức đến 100 mL. Ta được dung dịch ibuprofen có nồng độ 1000(ppm). Từ dung dịch này ta pha loãng ra các nồng độ 200 (ppm); 400(ppm); 600 (ppm); 800(ppm).
Dung dịch mẫu giả: pha từ các dung dịch chuẩn mẫu ở trên để được 2 mẫu giả:
+ Mẫu 1: dung dịch h n hợp paracetamol 325ppm và ibuprofen 200ppm. + Mẫu 2 : dung dịch h n hợp paracetamol 500ppm và ibuprofen 200ppm
Xử lí mẫu thuốc
-Nghiền nhỏ mẫu thuốc sau đó đem hịa vào 1000mL dd đệm,lắc đều, rung siêu âm, sau đó ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45 μm trước khi bơm vào hệ thống HPLC.
Dung môi pha động:
- Kênh A: Cân chính xác 3,5598g Na2HPO4 cho vào bình 1 lít, sau đó định mức thành 1000 mL bằng nước cất 2 lần. Dùng máy pH điều chỉnh pH = 6 bằng axit H3PO4 đặc nồng độ 85 % ta được dung dịch đệm phosphat có pH = 6. Dung dịch đệm phosphat trong bình 1000 mL được lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi đưa vào hệ thống HPLC.
- Kênh B: đưa vào kênh B của hệ thống máy HPLC dung dịch axetonnitril của merck.
2.6. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phƣơng pháp UV-Vis
Cân chính xác lần lượt là 50 mg paracetamol , ibuprofen cho vào hai bình định mức 100 mL khác nhau. Đem hòa tan và định mức bằng dung dịch HCl 0,1M, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút. Thu được các dung dịch paracetamol và ibuprofen có nồng độ là 500 µg/mL. Pha lỗng các dung dịch trên thành các dung dịch có nồng độ là 50 µg/mL. Tiếp tục pha lỗng các dung dịch trên thành các dung dịch có nồng độ 10 µg/mL, 20 µg/mL, 25 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL bằng dung dịch HCl 0,1M để tiến hành khảo sát.
Lấy các dung dịch paracetamol và ibuprofen có nồng độ là 50 µg/mL để pha lỗng thành các dung dịch có nồng độ là 10 µg/mL. Tiếp tục pha loãng các dung dịch trên thành các dung dịch có nồng độ 1µg/mL, 1,5 µg/mL, 2 µg/mL, 4 µg/mL, 6 µg/mL, 8 µg/mL.
Lấy các dung dịch paracetamol và ibuprofen có nồng độ là 10 µg/mL để pha lỗng thành các dung dịch có nồng độ là 1 µg/mL. Tiếp tục pha lỗng các dung dịch trên thành các dung dịch có nồng độ 0,2 µg/mL, 0,4 µg/mL, 0,6 µg/mL, 0,8 µgmL.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phƣơng pháp HPLC
3.1.1. Khảo sát lựa chọn bƣớc sóng
Tiến hành quét phổ hấp thụ của dung dịch chứa các chất riêng rẽ paracetamol và ibuprofen từ bước sóng 200 nm đến 410 nm. Các điều kiện khác cố định không đổi gồm kênh A là dung dịch đệm phosphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 90:10 về thể tích, tốc độ dịng là 0,6 mL/phút. Sắc đồ quét phổ thu được như sau:
7.088 Extracted 218.7 263.7 AU 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 nm 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00
5.418 Peak 1 247.1 AU 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 nm 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00 Hình 3.2. Sắc đồ quét phổ hấp phụ paracetamol
Nhận xét: Trong cùng điều kiện, Khi tiến hành quét phổ hấp thụ của
dung dịch chứa các chất paracetamol và ibuprofen riêng rẽ thì các bước sóng cực đại phát hiện của 2 chất này thu được tương ứng ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Bƣớc sóng hấp thụ cực đại của paracetamol và ibuprofen.
Chất Bƣớc sóng phát hiện (nm)
Paracetamol 247,1
Ibuprofen 218,7
Từ kết quả trên, tôi lựa chọn Detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng chất paracetamol 247,1nm và ibuprofen 218,7nm
3.1.2. Khảo sát lựa chọn tốc độ dịng chảy
Tơi tiến hành khảo sát pha động ở tốc độ là 0,6 mL/phút; 0,7 mL /phút; 0,8 mL /phút; 0,9 mL /phút; 1,0 mL /phút. Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm kênh A là dung dịch đệm phosphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 90:10 về thể tích, detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng chất paracetamol 247nm và ibuprofen 218nm. Kết quả khảo sát được trình bày chi tiết ở phụ lục 1. Sắc ký đồ của h n hợp ở tốc độ dịng 0,6 mL/ phút được trình bày ở hình 3.3
Hình 3.3. Sắc ký đồ của hỗn hợp paracetamol và ibuprofen ở tốc độ dòng 0,6 mL/phút
Nhận xét :Dưa vào kết quả khảo sát tốc độ dòng của pha động ta thấy rằng, tốc độ dòng ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số tách. Tốc độ dòng từ 0,6-1,0 mL /phút cho thấy thời gian lưu giảm dần, peak rõ đẹp, tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần. Tốc độ dịng lớn sẽ làm hao tốn dung mơi và tăng áp suất cột tách, nhưng tốc độ quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian phân tích và làm dỗng peak gây ra hiện tượng kéo đi. Do đó, tơi chọn tốc độ dịng là 0,6 mL/phút để tiến hành định lượng paracetamol và ibuprofen.
3.1.3. Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động
Tôi sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Khảo sát hệ dung môi pha động với tỷ lệ đệm phosphat (pH=6): ACN theo các tỉ lệ 40:60, tỉ lệ 30:70, tỉ lệ 20:80 và tỉ lệ 10:90. Các điều kiện khác cố định khơng đổi bao gồm tốc độ dịng là 0,6 mL/phút, bước sóng chọn lọc đối với từng chất paracetamol 247,1 nm và ibuprofen 218,7nm. Kết quả khảo sát
được trình bày chi tiết ở phụ lục 2. Sắc ký đồ của h n hợp với thành phần pha động kênh A là dung dịch đệm phosphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 90:10 về thể tích được trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Sắc ký đồ của hỗn hợp paracetamol và ibuprofen với tỉ lệ pha động 10:90
Nhận xét: tỉ lệ pha động 10:90 là tối ưu nhất để tách 2 chất. 3.1.4. Khảo sát sự ảnh hƣởng của pH
Để khảo sát sự ảnh hưởng của pH, tôi sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Khảo sát hệ dung môi pha động với tỷ lệ đệm phosphat (pH=6): ACN theo tỉ lệ 10:90. Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm tốc độ dòng là 0,6 mL/phút, bước sóng chọn lọc đối với từng chất paracetamol 247,1nm và ibuprofen 218,7nm. Dùng axit phosphoric thay đổi pH của dung dịch đệm. Kết quả khảo sát được trình bày chi tiết ở phụ lục 3. Sắc ký đồ của h n hợp ở pH = 6 được trình bày ở hình 3.5.
AU 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00
Nhận xét : Dựa vào kết quả phân tích được, ta chọn dung dịch đệm có pH=6 vì nằm trong giới hạn cho phép của cột, peak sắc ký rõ nét, cân đối, ít tốn thời gian phân tích và dung mơi pha động.
Kết luận chung: Từ kết quả trên, tôi lựa chọn điều kiện tối ưu cho phép xác định paracetamol và ibuprofen bằng phương pháp HPLC là:
Cột tách: cột C18.
Detector PDA bước sóng chọn lọc đối với từng chất paracetamol 247,1nm và ibuprofen 218,7nm trong cùng một phép đo.
Tốc độ dòng chảy: 0,6 mL/phút.
Pha động: kênh A: dung dịch đệm phosphat (pH=6) + kênh B: dung dịch axetonitril tỉ lệ 10:90 về thể tích.
Dung mơi pha mẫu: dung dịch đệm phosphat (pH=6) và dung dịch axetonitril tỉ lệ 10:90 về thể tích.
3.1.5. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ paracetamol và ibuprofen
Độ tuyến tính được khảo sát trên dung dịch các chất chuẩn với các nồng độ paracetamol và ibuprofen được khảo sát khoảng tuyến tính từ 100 đến 500 ppm. Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên. Xác định được sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của 2 chất được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Khoảng nồng độ tuyến tính của paracetamol và ibuprofen
Paracetamol Ibuprofen Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mAuxphút) Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mAuxphút) 100 1945623 50 2190087 200 3986457 100 4382129 250 4742599 150 6493218 300 5775987 200 8764258 350 7006986 250 10869987 400 8011247 300 13678975 450 8754976 350 15678542 500 9966668 400 17853789 y = 19987x-96916 y = 45188x + 178501 R2 = 0,998 R2 = 0,9991
Nhận xét:
Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1.
Từ kết quả ở bảng 3.2, tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị 3.6; 3.7.
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của ibuprofen
Nồng độ (ppm)
Nồng độ (ppm)
3.1.6. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ parracentamol và ibuprofen bằng phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic, ibuprofen bằng phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic, Dibulaxan và Travicol
Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ parracentamol và ibprofen
bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
Cân chính xác thuốc Ibucapvic (0,0195 gam) ứng với 8,125mg paracetamol, 5mg ibuprofen cho vào ống nhựa ly tâm (50 mL) được đánh số thứ tự. Hút chính xác lần lượt 5 mL paracetamol và ibuprofen chuẩn với các nồng độ gốc như bảng 3, 4, 5 thêm vào các ống tương ứng, sau đó thêm dung mơi pha mẫu để tổng thể tích 25mL. Lắc đều, rung siêu âm, ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45μm.
Bảng 3.3. Xây dựng đƣờng chuẩn paracetamol theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
Mẫu 1 7 8 9 10 11
Khối lượng thuốc (g) 0,0195 0,0195 0,1956 0,0195 0,0195 0,0195 Thể tích Ibuprofen thêm
vào (mL) - 5,0 5,0 7,5 10,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen thêm
vào (ppm) - 500 1000 1000 1000 1000
Thể tích dung mơi pha
mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 17,5 15,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen sau
khi pha (ppm) 200 300 400 500 600 700
Bảng 3.4. Xây dựng đƣờng chuẩn Ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
Mẫu 1 7 8 9 10 11
Khối lượng thuốc (g) 0,0195 0,0195 0,1956 0,0195 0,0195 0,0195 Thể tích Ibuprofen thêm
vào (mL) - 5,0 5,0 7,5 10,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen thêm
vào (ppm) - 500 1000 1000 1000 1000
Thể tích dung mơi pha
mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 12,5 15,0 7,5
Nồng độ Ibuprofen sau
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên thu được kết quả như bảng 3.5
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của paracetamol bằng phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic 1 325 0 325 6397129 2 325 100 425 8387595 3 325 200 525 10416545 4 325 300 625 12064646 5 325 400 725 14394255 6 325 500 825 16402354 y = 19913x - 106008 R2 = 0,9987
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến
tính (phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 19913x - 106008) giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9987)
Từ kết quả ở bảng 3.5 tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị hình 3.8
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol theo phương pháp thêm chuẩn
trên nền thuốc Ibucapvic
Diện tích pic mAuxphut
Nồng độ (ppm)
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic 1 200 0 200 9041646 2 200 100 300 13783795 3 200 200 400 18266464 4 200 300 500 22318689 5 200 400 600 28035346 6 200 500 700 31726567 y = 45780x-72440 R2 = 0,998
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan
tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ (phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 45780x-72440) với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,998).
Từ kết quả ở bảng 3.6, tơi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị như hình 3.9
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của Ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
Diện tích pic (mAuxphut)
Nồng độ (ppm)
. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ parracentamol và ibprofen bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Dibulaxan
Cân chính xác thuốc Dibulaxan (0,021 gam) ứng với 8,125mg paracetamol, 5mg ibuprofen cho vào ống nhựa ly tâm (50 mL) được đánh số thứ tự. Hút chính xác lần lượt 5 mL paracetamol và ibuprofen chuẩn với các nồng độ gốc như bảng 3,4,5 thêm vào các ống tương ứng, sau đó thêm dung mơi pha mẫu để tổng thể tích 25mL. Lắc đều, rung siêu âm, ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45μm.
Bảng 3.7. Xây dựng đƣờng chuẩn paracetamol theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Dibulaxan
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Khối lượng thuốc (g) 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 Thể tích paracetamol thêm
vào (mL) - 5,0 5,0 7,5 10,0 12,5
Nồng độ paracetamol thêm
vào (ppm) - 500 1000 1000 1000 1000
Thể tích dung môi pha mẫu
(mL) 25,0 20,0 20,0 17,5 15,0 12,5
Nồng độ paracetamol sau
khi pha (ppm) 325 425 525 625 725 825
Bảng 3.8. Xây dựng đƣờng chuẩn Ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Dibulaxan
Mẫu 1 7 8 9 10 11
Khối lượng thuốc (g) 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 Thể tích Ibuprofen thêm