Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Tổng quan về phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
1.3.2. Tính chất quang học của chất hấp thụ ánh sáng
Tính chất quan trọng nhất đó là tính cộng tính. Tính cộng tính này được thể hiện theo 3 nội dung sau:
- Tính cộng tính theo chiều dày của dung dịch hấp thụ màu
Nếu có thể chia dung dịch hấp thụ màu thành n phần nhỏ thì tổng độ hấp thụ quang của các tiểu phần là độ hấp thụ quang của toàn bộ dung dịch màu. Ứng dụng tính chất này, có thể tăng độ hấp thụ quang của dung dịch màu lỗng bằng việc sử dụng cuvet có kích thước hơn lớn hoặc giảm độ hấp thụ quang của dung dịch màu có nồng độ lớn bằng việc sử dụng cuvet có kích thước nhỏ hơn, để việc đo độ hấp thụ quang đạt độ chính xác cao. Trong thực tế, chỉ sản xuất các cuvet có độ dày từ 0,1 đến 10cm, thường là cuvet 1cm. Không dùng các loại cuvet nhỏ hơn 0,1cm, vì lúc này rất khó rót dung dịch
vào cuvet; không dùng các loại cuvet lớn hơn 10cm, vì lúc này sự khúc xạ ánh sáng quá lớn gây sai số phân tích.
- Tính cộng tính theo nồng độ chất hấp thụ màu
Nếu có thể chia nồng độ chất hấp thụ màu thành n phần nhỏ thì tổng độ hấp thụ quang của các tiểu phần là độ hấp thụ quang của toàn bộ dung dịch màu. Ứng dụng tính chất này, có thể tăng độ hấp thụ quang của dung dịch màu loãng bằng việc cách cho thêm chất màu hoặc giảm độ hấp thụ quang của dung dịch màu có nồng độ lớn bằng cách pha lỗng dung dịch màu hay lấy lượng chất màu ít hơn để phân tích.
- Tính cộng tính theo thành phần các chất hấp thụ màu
Nếu trong dung dịch có n chất hấp thụ màu và m i chất màu đều tuân thủ định luật Bouguer – Lambert – Beer thì tổng độ hấp thụ quang của các chất màu là độ hấp thụ quang của tồn bộ dung dịch. Ứng dụng tính chất này có thể có thể giải bài tốn phân tích nhiều chất màu trong dung dịch phân tích. Dùng máy đo để xác định độ hấp thụ quang. Ngồi việc đo A, cịn có thể đo độ truyền quang T%:
0 % I .1 0 0
T I
. Tuy nhiên, phép đo này ít được sử dụng trong phân tích định lượng, vì hàm số T% = f(C) khơng tuyến tính như hàm số A = f(C). Thường chỉ dùng đo T% khi căn chỉnh máy đo. Lưu ý: T% = 100 thì A = 0.
1.3.3. Các bƣớc tiến hành phép đo UV-Vis
Bản chất của phổ hấp thụ phân tử UV-Vis:
Khi chiếu một chùm sáng có bước sóng phù hợp đi qua một dung dịch chất màu, các phân tử sẽ hấp thụ một phần năng lượng chùm sáng, một phần ánh sáng truyền qua dung dịch. Xác định cường độ chùm ánh sáng truyền qua đó ta có thể xác định được nồng độ của dung dịch. Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch tuân theo định luật Bouguer – Lambert – Beer:
o / t
Bước 1. Chọn bước sóng
Nghiên cứu sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch A (hoặc hệ số hấp thụ ε) theo bước sóng λ, tức là đo A (hoặc ε) của dung dịch nghiên cứu với các tia bức xạ điện từ có λ khác nhau, sau đó lập đồ thị hệ toạ độ A – λ (hoặc ε – ). Đồ thị này có dạng đường cong Gauss. Cực đại Amax (εmax) ứng với giá trị λmax gọi là cực đại hấp thụ. Khi tiến hành phân tích theo quang phổ đo quang chọn đo độ hấp thụ quang A của dung dịch nghiên cứu tại λmax. Bởi vì với việc đo A ở λmax cho kết quả phân tích có độ nhạy và độ chính xác tốt nhất.
Bước 2. Chuẩn bị mẫu phân tích
Mẫu phân tích có thể ở dạng rắn, lỏng nhưng thông thường người ta hay chuẩn bị mẫu phân tích là những chất lỏng hoặc ở dạng dung dịch. Nếu chất nghiên cứu là những chất rắn khơng tan, người ta có thể tìm cách hồ tan chúng bằng các dung mơi và các biện pháp thích hợp. Sau đó nếu chất nghiên cứu là hợp chất khơng có hiệu ứng phổ hấp thụ, thì phải chế hố dung dịch bằng các biện pháp như phản ứng oxy hoá khử, phản ứng tạo phức chất... sau đó đem nghiên cứu. Nếu chất nghiên cứu là những chất khí thì sẽ được nghiên cứu trong các cuvet đặc biệt.
Bước 3. Ghi phổ
Sau khi đã chế hoá mẫu, mẫu được chuyển vào cuvet ghi phổ hấp thụ, chọn λmax và đo độ hấp thụ quang ở λmax.
Bước 4. Xử lý số liệu
Các số liệu thu được có thể ở dạng các đường ghi phổ hệ toạ độ A – λ hoặc ε – λ, bảng số liệu về thành phần chất nghiên cứu, đồ thị cần thiết tuỳ thủ tục thực nghiệm đã chọn.
- Trang thiết bị phương pháp UV-Vis
Theo những nguyên lý cơ bản đã xét trong thực tế ta phải đo độ hấp thụ quang bằng cách đo cường độ bức xạ truyền đi từ nguồn sáng qua mẫu trắng tới detectơ và cường độ bức xạ từ nguồn qua chất nghiên cứu đến detectơ.
Như vậy ta có thể hình dung một cách khái quát thiết bị đo độ hấp thụ quang như sau:
- Nguồn phát tia bức xạ - Bộ lọc sáng
- Cuvet - Detector [9, 14, 18, 33].
1.3.4. Một số kết quả xác định thành phần theo phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Năm 2005, Thái Duy Thìn và cộng sự đã định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen trong viên nén Dibulaxan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) trong dung dịch đệm photphat có pH= 7, khoảng bước sóng quét phổ từ 200 – 300 nm. Ibuprofen hấp thụ cực đại ở bước sóng 222nm với độ hấp thụ quang cực đại paracetamol tại λmax=243 nm. Độ thu hồi của ibuprofen từ 97,2% đến 99,2% và paracetamol từ 100,1% đến 101,2 %
Năm 2011, tác giả Lê Ngọc Anh đã xác định thành công paracetamol, loratadin và dextromethophan HBr trong thuốc viên nén hapacol-CF bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử. Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paracetamol, loratadin và detromethophan HBr trong h n hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để qt phổ từ 210-285 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol λmax=244 nm, loratadin λmax=273 nm và dextromethophan HBr λmax=278nm; trong môi trường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang của paracetamol, loratadin và dextromethophan HBr ổn định và đạt cực đại; khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm là 30 đến 60 phút sau khi pha và tại nhiệt độ 250C. Kết quả: xác định được LOD, LOQ và khoảng tuyến tính của paracetamol: 1,3÷25 μg/mL, loratadin: 1,3÷80 μg/mL, dextromethophan HBr: 0,6÷100 μg/mL. Độ thu hồi của paracetamol từ 101,08% đến 102,08%, loratadin từ 92,9% đến 99,45%, dextromethophan HBr từ 99,78% đến 102,24%
Năm 2012, Siladitya Behera và các cộng sự xác định thành công paracetamol trong thuốc viên nén sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis. Điều kiện tối ưu để xác định paracetamol: Khoảng bước sóng thích hợp để qt phổ từ 200-400 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol λmax = 243 nm. Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là trong khoảng 8 giờ ở nhiệt độ phòng. Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của paracetamol là 0,0 đến 150,0 μg/mL, độ thu hồi của paracetamol từ 98,54% đến 99,13% Năm 2013, tác giả Mai Xuân Trường đã xác định thành công dextromethophan HBr, clopheninamin maleat và guaifenesin trong thuốc viên methophan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử. Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời dextromethophan HBr, clopheninamin maleat và guaifenesin trong h n hợp là khoảng bước sóng từ 210 - 285 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch dextromethophan HBr λmax = 278nm, clopheninamin maleat λmax = 264nm và guaifenesin λmax = 273nm; trong môi trường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang của dextromethophan HBr, clopheninamin maleat và guaifenesin có sự ổn định và đạt cực đại; khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là 30 đến 60 phút sau khi pha và đo tại nhiệt độ phòng. Kết quả thu được: xác định được LOD, LOQ và khoảng tuyến tính của dextromethophan HBr: 0,5÷100μg/mL, clopheninamin maleat: 0,2÷50μg/mL, guaifenesin: 0,1÷50μg/mL. độ thu hồi của dextromethophan HBr từ 96,60% đến 101,08%, clopheninamin maleat từ 98,70% đến 102,03%, guaifenesin từ 99,01% đến 103,00%
Năm 2014, tác giả Vũ Duy Long xác định thành công đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong thuốc TIFFY. Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong h n hợp là khoảng bước sóng từ
210-290 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol λmax = 244 nm, clopheninamin maleat λmax = 264 nm và phenylephin hydroclorit λmax = 273 nm trong môi trường axit HCl 0,1M. Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 20 đến 90 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phịng. Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của paracetamol là 0,2 đến 30,0 μg/mL, clopheninamin maleat là từ 0,2 đến 40,0 μg/mL và phenylephin hydroclorit là từ 1,0 đến 40,0 μg/mL, độ thu hồi của paracetamol từ 99,8% đến 100,2%, của phenylephin hydroclorit là từ 99,1% đến 99,6% và của clopheninamin maleat là từ 98,1% đến 100,7
Năm 2015, tác giả Nguyễn Thị Thuỳ Thương đã xác định thành công đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat trong thuốc Coldamin và Pacemin. Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat trong h n hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-290 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol λmax = 243 nm, clopheninamin maleat λmax = 273 nm trong môi trường axit HCl 0,1M. Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 30 đến 40 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phịng. Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của paracetamol là 0,2 đến 30,0 μg/mL, cafein 0,2 đến 30,0 μg/mL, độ thu hồi của paracetamol từ 96,3% đến 99,1%, của clopheninamin maleat là từ 95,5% đến 98,3%
Năm 2015, tác giả Trần Quốc Chính đã xác định thành cơng đồng thời paracetamol, codein phot phat trong thuốc Actadol codein. Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paracetamol, codein phot phat trong h n hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-290 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol λmax = 243 nm, codein λmax = 210 nm trong môi trường axit HCl 0,1M. Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 30 đến 40 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phịng. Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của paracetamol là 0,2 đến 30,0 μg/mL, cafein 0,2 đến
30,0 μg/mL, độ thu hồi của paracetamol từ 99,3% đến 101,1%, của codein là từ 98,5% đến 100,3%
Năm 2016, tác giả Liễu Thanh Nhàn xác định thành công đồng thời paracetamol, loratadin, dextromethophan HBr trong thuốc Rhumenol Flu 500 bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử với điều kiện tối ưu là: khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200-300 nm, paracetamol λmax = 243 nm, loratadin λmax = 273 nm và dextromethophan λmax = 279,5 nm trong môi trường axit HCl 0,1M. Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 30 đến 90 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phịng. Khảo sát, xác định khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của paracetamol là 0,1 đến 25,0 μg/mL, loratadin là từ 0,1 đến 50,0 μg/mL và dextromethophan là từ 0,1 đến 50,0 μg/mL. Đã xác định đồng thời paracetamol, loratadin và dextromethophan trong h n hợp 2 và 3 cấu tử cho thấy: có thể xác định được paracetamol trong h n hợp tương đối chính xác, phải sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định hàm lượng loratadin
và dextromethophan trong mẫu thuốc Rhumenol Flu 500. Sử dụng phương pháp thêm chuẩn xác định paracetamol, loratadin và dextromethophan trong mẫu thuốc Rhumenol Flu 500 với độ thu hồi của paracetamol từ 99,6% đến 100,5%, của loratadin là từ 99,98% đến 100,01% và của dextromethophan là từ 99,66% đến 101,13%
1.4. Giới thiệu về thuốc Ibucapvic, Dibulaxan và Travicol
Hiện nay thuốc Ibucapvic, Dibulaxan và Travicol là 3 loại dược phẩm chứa đồng thời ibuprofen và paracetamol đang được lưu hành rộng dãi trên thị trường, được bán không cần kê đơn để giảm đau và hạ sốt.
Hình 1.6. Thuốc Ibucapvic Thuốc Ibucapvic Hình 1.7. Thuốc Dibulaxan Hình 1.8. Thuốc Travicol
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu theo phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
2.1.1. Nội dung nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu gồm các nội dung sau: 1. Chọn detector
2. Chọn pha tĩnh
3. Lựa chọn dung môi. 4. Chọn pha động
5. Khảo sát bước sóng hấp thụ quang của paracetamol và ibuprofen. 6. Khảo sát tỉ lệ thành phần pha động
7. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy 8. Chuẩn bị các dung dịch phân tích.
9. Khảo sát độ tuyến tính của chất phân tích.
2.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký
a. Chọn detector
Paracetamol và Ibuprofen đều hấp thụ ánh sáng mạnh trong vùng tử ngoại (UV). Mặt khác detector PDA cho phép quan trắc các chất tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 500 nm trong cùng một phép đo. Đây là điểm ưu việt của detector PDA. Căn cứ vào những điều trên, tơi chọn detector phù hợp cho phép phân tích là detector PDA.
b. Chọn pha tĩnh
Pha tĩnh thông dụng nhất là silicagan có gắn gốc ankyl mạch dài, khơng phân cực, thông dụng nhất là -C18H37. Khoảng 61% các máy HPLC sử dụng loại cột chứa pha tĩnh này. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, tơi lựa chọn cột C18 với đường kính hạt pha tĩnh là 5 μm, chiều dài cột tách 250 mm, và
đường kính cột 6,1 mm để tìm các điểu kiện khác tối ưu hóa việc tách để xác định paracetamol và ibuprofen.
c. Lựa chọn dung mơi
Căn cứ vào tính chất của paracetamol và ibuprofen cùng các tài liệu tham khảo. Tôi chọn dung dịch đệm phosphat (pH=6) làm dung môi cho quá trình nghiên cứu.
d. Lựa chọn pha động
Trong quá trình sắc ký, pha động được chọn như thế nào là tùy thuộc vào tính chất của mẫu phân tích hoặc nồng độ. Pha động có thể là dung mơi đơn hay h n hợp nhiều dung mơi được trộn theo tỉ lệ thích hợp. Khi chọn pha động cần chú ý đến một số yêu cầu sau:
- Trơ và khơng tác dụng hóa học với pha tĩnh. - Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc ký. - Hòa tan tốt h n hợp các chất phân tích. - Phù hợp với loại detector đã chọn.
Pha động là một yếu tố rất linh động, ta có thể dễ dàng thay đổi để thu được kết quả tách tốt nhất bằng cách thay đổi tỉ lệ thành phần các loại dung môi hữu cơ. Pha động có thể là hệ dung môi không phân cực hoặc hệ dung môi phân cực. người ta thường dùng nhất là hệ CH3OH - H2O hoặc hệ axetonitril - dung dịch đệm phosphat. Hệ sắc ký này có thể dùng để tách nhiều h n hợp từ phân cực đến khơng phân cực, vì vậy phạm vi sử dụng phong phú hơn. Trong các nghiên cứu gần đây, phương pháp sắc ký lỏng pha ngược HPLC sử dụng thành phần pha động gồm kênh A là đệm phosphat và kênh B là axetonitril được sử dụng rất hiệu quả trong việc phân tích đồng thời paracetamol và ibuprofen trong nhiều mẫu dược phẩm.
Do đó, tơi lựa chọn dung mơi pha động gồm kênh A là đệm phosphat và kênh B là axetonitril để xác định đồng thời paracetamol và ibuprofen trong mẫu thuốc.
e. Khảo sát bước sóng hấp thụ quang của paracetamol và ibuprofen trên thiết bị HPLC
Trong nghiên cứu này, tôi chuẩn bị các dung dịch chuẩn paracetamol có nồng độ 325 ppm, dung dịch chuẩn ibuprofen có nồng độ 200ppm. Sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Do các chất trên hấp thụ ánh sáng mạnh trong vùng tử ngoại (UV). Tôi chọn detector PDA khảo sát tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 410 nm. Các điều kiện khác cố