Tôi sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Khảo sát hệ dung môi pha động với tỷ lệ đệm phosphat (pH=6): ACN theo các tỉ lệ 40:60, tỉ lệ 30:70, tỉ lệ 20:80 và tỉ lệ 10:90. Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm tốc độ dòng là 0,6 mL/phút, bước sóng chọn lọc đối với từng chất paracetamol 247,1 nm và ibuprofen 218,7nm. Kết quả khảo sát
được trình bày chi tiết ở phụ lục 2. Sắc ký đồ của h n hợp với thành phần pha động kênh A là dung dịch đệm phosphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 90:10 về thể tích được trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Sắc ký đồ của hỗn hợp paracetamol và ibuprofen với tỉ lệ pha động 10:90
Nhận xét: tỉ lệ pha động 10:90 là tối ưu nhất để tách 2 chất. 3.1.4. Khảo sát sự ảnh hƣởng của pH
Để khảo sát sự ảnh hưởng của pH, tôi sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Khảo sát hệ dung môi pha động với tỷ lệ đệm phosphat (pH=6): ACN theo tỉ lệ 10:90. Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm tốc độ dòng là 0,6 mL/phút, bước sóng chọn lọc đối với từng chất paracetamol 247,1nm và ibuprofen 218,7nm. Dùng axit phosphoric thay đổi pH của dung dịch đệm. Kết quả khảo sát được trình bày chi tiết ở phụ lục 3. Sắc ký đồ của h n hợp ở pH = 6 được trình bày ở hình 3.5.
AU 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00
Nhận xét : Dựa vào kết quả phân tích được, ta chọn dung dịch đệm có pH=6 vì nằm trong giới hạn cho phép của cột, peak sắc ký rõ nét, cân đối, ít tốn thời gian phân tích và dung môi pha động.
Kết luận chung: Từ kết quả trên, tôi lựa chọn điều kiện tối ưu cho phép xác địnhparacetamol và ibuprofen bằng phương pháp HPLC là:
Cột tách: cột C18.
Detector PDA bước sóng chọn lọc đối với từng chất paracetamol 247,1nm và ibuprofen 218,7nmtrong cùng một phép đo.
Tốc độ dòng chảy: 0,6 mL/phút.
Pha động: kênh A: dung dịch đệm phosphat (pH=6) + kênh B: dung dịch axetonitril tỉ lệ 10:90 về thể tích.
Dung môi pha mẫu: dung dịch đệm phosphat (pH=6) và dung dịch axetonitril tỉ lệ 10:90 về thể tích.
3.1.5. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ paracetamol và ibuprofen
Độ tuyến tính được khảo sát trên dung dịch các chất chuẩn với các nồng độ paracetamol và ibuprofen được khảo sát khoảng tuyến tính từ 100 đến 500 ppm. Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên. Xác định được sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của 2 chất được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Khoảng nồng độ tuyến tính của paracetamol và ibuprofen
Paracetamol Ibuprofen Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mAuxphút) Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mAuxphút) 100 1945623 50 2190087 200 3986457 100 4382129 250 4742599 150 6493218 300 5775987 200 8764258 350 7006986 250 10869987 400 8011247 300 13678975 450 8754976 350 15678542 500 9966668 400 17853789 y = 19987x-96916 y = 45188x + 178501 R2 = 0,998 R2 = 0,9991
Nhận xét:
Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1.
Từ kết quả ở bảng 3.2, tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị 3.6; 3.7.
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của ibuprofen
Nồng độ (ppm)
Nồng độ (ppm)
3.1.6. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ parracentamol và ibuprofen bằng phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic, ibuprofen bằng phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic, Dibulaxan và Travicol
Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ parracentamol và ibprofen
bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
Cân chính xác thuốc Ibucapvic (0,0195 gam) ứng với 8,125mg paracetamol, 5mg ibuprofen cho vào ống nhựa ly tâm (50 mL) được đánh số thứ tự. Hút chính xác lần lượt 5 mL paracetamol và ibuprofen chuẩn với các nồng độ gốc như bảng 3, 4, 5 thêm vào các ống tương ứng, sau đó thêm dung môi pha mẫu để tổng thể tích 25mL. Lắc đều, rung siêu âm, ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45μm.
Bảng 3.3. Xây dựng đƣờng chuẩn paracetamol theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
Mẫu 1 7 8 9 10 11
Khối lượng thuốc (g) 0,0195 0,0195 0,1956 0,0195 0,0195 0,0195 Thể tích Ibuprofen thêm
vào (mL) - 5,0 5,0 7,5 10,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen thêm
vào (ppm) - 500 1000 1000 1000 1000
Thể tích dung môi pha
mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 17,5 15,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen sau
khi pha (ppm) 200 300 400 500 600 700
Bảng 3.4. Xây dựng đƣờng chuẩn Ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
Mẫu 1 7 8 9 10 11
Khối lượng thuốc (g) 0,0195 0,0195 0,1956 0,0195 0,0195 0,0195 Thể tích Ibuprofen thêm
vào (mL) - 5,0 5,0 7,5 10,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen thêm
vào (ppm) - 500 1000 1000 1000 1000
Thể tích dung môi pha
mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 12,5 15,0 7,5
Nồng độ Ibuprofen sau
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên thu được kết quả như bảng 3.5
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của paracetamol bằng phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic 1 325 0 325 6397129 2 325 100 425 8387595 3 325 200 525 10416545 4 325 300 625 12064646 5 325 400 725 14394255 6 325 500 825 16402354 y = 19913x - 106008 R2 = 0,9987
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến
tính (phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 19913x - 106008) giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9987)
Từ kết quả ở bảng 3.5 tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị hình 3.8
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol theo phương pháp thêm chuẩn
trên nền thuốc Ibucapvic
Diện tích pic mAuxphut
Nồng độ (ppm)
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic 1 200 0 200 9041646 2 200 100 300 13783795 3 200 200 400 18266464 4 200 300 500 22318689 5 200 400 600 28035346 6 200 500 700 31726567 y = 45780x-72440 R2 = 0,998
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan
tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ (phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 45780x-72440) với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,998).
Từ kết quả ở bảng 3.6, tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị như hình 3.9
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của Ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Ibucapvic
Diện tích pic (mAuxphut)
Nồng độ (ppm)
. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ parracentamol và ibprofen bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Dibulaxan
Cân chính xác thuốc Dibulaxan (0,021 gam) ứng với 8,125mg paracetamol, 5mg ibuprofen cho vào ống nhựa ly tâm (50 mL) được đánh số thứ tự. Hút chính xác lần lượt 5 mL paracetamol và ibuprofen chuẩn với các nồng độ gốc như bảng 3,4,5 thêm vào các ống tương ứng, sau đó thêm dung môi pha mẫu để tổng thể tích 25mL. Lắc đều, rung siêu âm, ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45μm.
Bảng 3.7. Xây dựng đƣờng chuẩn paracetamol theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Dibulaxan
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Khối lượng thuốc (g) 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 Thể tích paracetamol thêm
vào (mL) - 5,0 5,0 7,5 10,0 12,5
Nồng độ paracetamol thêm
vào (ppm) - 500 1000 1000 1000 1000
Thể tích dung môi pha mẫu
(mL) 25,0 20,0 20,0 17,5 15,0 12,5
Nồng độ paracetamol sau
khi pha (ppm) 325 425 525 625 725 825
Bảng 3.8. Xây dựng đƣờng chuẩn Ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Dibulaxan
Mẫu 1 7 8 9 10 11
Khối lượng thuốc (g) 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 Thể tích Ibuprofen thêm
vào (mL) - 5,0 5,0 7,5 10,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen thêm
vào (ppm) - 500 1000 1000 1000 1000
Thể tích dung môi pha mẫu
(mL) 25,0 20,0 20,0 17,5 15,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen sau khi
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên thu được kết quả như bảng 3.9
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của paracetamol bằng phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Dibulaxan
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic 1 325 0 325 6421615 2 325 100 425 8564641 3 325 200 525 10964194 4 325 300 625 13149467 5 325 400 725 15127982 6 325 500 825 16946649 y=21286x-376938 R² = 0,9979
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến
tính giữa diện tích pic và nồng độ (phương trình hồi quy tuyến tính là: y=21286x-376938) với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9979).
Từ kết quả ở bảng 3.9, tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị hình 3.10.
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol theo phương pháp thêm chuẩn
trên nền thuốc Dibulaxan
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Dibulaxan
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic 1 200 0 200 9146366 2 200 100 300 13856476 3 200 200 400 18364979 4 200 300 500 23464151 5 200 400 600 28168619 6 200 500 700 31846732 y=46154x + 38789 R² = 0,9984
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến
tính giữa diện tích pic và nồng độ (phương trình hồi quy tuyến tính là: y=46154x + 38789) với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9984).
Từ kết quả ở bảng 3.10 tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị như hình 3.11.
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của Ibuprofen theo phương pháp thêm chuẩn
trên nền thuốc Dibulaxan
. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ parracentamol và ibprofen bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Travicol
Cân chính xác thuốc Travicol (0,0182 gam) ứng với 12,5mg paracetamol, 5mg ibuprofen cho vào ống nhựa ly tâm (50 mL) được đánh số thứ tự. Hút chính xác lần lượt 5 mL paracetamol và ibuprofen chuẩn với các nồng độ gốc như bảng 3,4,5 thêm vào các ống tương ứng, sau đó thêm dung môi pha mẫu để tổng thể tích 25mL. Lắc đều, rung siêu âm, ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45μm.
Bảng 3.11. Xây dựng đƣờng chuẩn paracetamol theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Travicol
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Khối lượng thuốc (g) 0,0182 0,0182 0,0182 0,0182 0,0182 0,0182 Thể tích paracetamol
thêm vào (mL) - 5,0 5,0 7,5 10,0 12,5
Nồng độ paracetamol
thêm vào (ppm) - 500 1000 1000 1000 1000
Thể tích dung môi pha
mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 17,5 15,0 12,5
Nồng độ paracetamol
sau khi pha (ppm) 500 600 700 800 900 1000
Bảng 3.12. Xây dựng đƣờng chuẩn Ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Travicol
Mẫu 1 7 8 9 10 11
Khối lượng thuốc (g) 0,0182 0,0182 0,0182 0,0182 0,0182 0,0182 Thể tích Ibuprofen thêm
vào (mL) - 5,0 5,0 7,5 10,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen thêm
vào (ppm) - 500 1000 1000 1000 1000
Thể tích dung môi pha
mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 17,5 15,0 12,5
Nồng độ Ibuprofen sau
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên thu được kết quả như bảng 3.13
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của paracetamol bằng phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Travicol
STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic 1 500 0 500 10516499 2 500 100 600 12149764 3 500 200 700 14002164 4 500 300 800 15992349 5 500 400 900 18056487 6 500 500 1000 20054779 y=19258x+685441 R² = 0,9985
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến
tính giữa diện tích pic và nồng độ (phương trình hồi quy tuyến tính là: y=19258x+685441) với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9985)
Từ kết quả ở bảng 3.13, tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị hình 3.12
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol theo phương pháp thêm chuẩn
trên nền thuốc Travicol
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền thuốc Travicol STT Ca (ppm) C (ppm) CT (ppm) Diện tích pic 1 200 0 200 9012311 2 200 100 300 13054112 3 200 200 400 17821947 4 200 300 500 22867941 5 200 400 600 26964989 6 200 500 700 30796617 y =44486x +67728 R² = 0,9981
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan
tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ (phương trình hồi quy tuyến tính là: y =44486x +67728) với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 = 0,9981).
Từ kết quả ở bảng 3.14, tôi biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ dưới dạng đồ thị như hình 3.13.
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của Ibuprofen theo phƣơng pháp thêm chuẩn
trên nền thuốc Travicol
3.1.7. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống
Để khảo sát tính thích hợp của hệ thống máy HPLC khi phân tích định lượng paracetamol và ibuprofen. Tôi khảo sát các đại lượng đặc trưng như: thời gian lưu, diện tích pic qua việc lặp lại 4 lần dung dịch chuẩn để sắc ký.
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát thời gian lƣu
Lần bơm 1 2 3 4
Thời gian lưu
paracetamol (phút) 2,215 2,210 2,219 2,195
Số liệu thống kê X = 2,210 S = 10,5 % RSD= 0,412% Thời gian lưu
Ibuprofen (phút) 3,911 3,899 3,996 4,000
Số liệu thống kê X = 3,952 S = 53,941 % RSD= 1,365%
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát diện tích pic
Lần bơm 1 2 3 4
Diện tích pic paracetamol
(mAuxphút) 3987626 3981789 3985178 3918063
Nồng độ paracetamol (ppm) 200 200 200 200
Số liệu thống kê X = 3968164 S =33486,3 %RSD =0,843 Diện tích pic Ibuprofen
(mAuxphút) 4790638 4789165 4798745 4789107
Nồng độ Ibuprofen (ppm) 200 200 200 200
Số liệu thống kê X = 4791913,75
S = 4068,94 %RSD = 0,096%
Từ kết quả các bảng 3.15 và 3.16 cho thấy: các thông số hệ thống nằm trong giới hạn cho phép. Chỉ số % RSD của diện tích pic và thời gian lưu được tìm thấy đều gần bằng 1%. Vì vậy hệ thống sắc ký đảm bảo tính thích hợp khi phân tích paracetamol và ibuprofen.
Để khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký. Chúng tối tiến hành đo các dung dịch mẫu giả của paracetamol và ibuprofen trong điều kiện sắc ký đã chọn, so sánh diện tích pic từ phương trình đường chuẩn và dung dịch mẫu giả trong cùng điều kiện. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.17.
Nhận xét: Từ bảng 3.17 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối %RSD của cả 2
chất phân tích đều gần bằng 1% (%RSDparacetamol =0.799%; % RSDibuprofen = 1.477%. Như vậy, phương pháp sắc ký định lượng đồng thời cả 2 chất có độ lặp lại cao.
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp Paracetamol Mẫu 1 2 3 4 Nồng độ lý thuyết (ppm) 300 300 300 300 Diện tích pic (mAuxphút) 6099054 6139028 6218976 6159015 Nồng độ xác định được (ppm) 310 312 316 313 Số liệu thống kê =312.75 S =2.5 Sx = 1.25 %RSD =0.799% Ibuprofen Nồng độ lý thuyết (ppm) 200 200 200 200 Diện tích pic (mAuxphút) 9667981 9622793 9893921 9577605 Nồng độ xác định được (ppm) 210 209 215 208 Số liệu thống kê =210.5 S =3.109 Sx =1.554563 %RSD=1.477%
3.1.8. Xác định paracetamol và ibuprofen trong thuốc Ibucapvic
Cân chính xác thuốc Ibucapvic 0,0195 gam gam cho vào ống nhựa ly tâm 50 mL, sau đó thêm dung môi pha mẫu để tổng thể tích 25mL. Lắc đều,