Các nội dung nghiên cứu gồm các nội dung sau: 1. Chọn detector
2. Chọn pha tĩnh
3. Lựa chọn dung môi. 4. Chọn pha động
5. Khảo sát bước sóng hấp thụ quang của paracetamol và ibuprofen. 6. Khảo sát tỉ lệ thành phần pha động
7. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy 8. Chuẩn bị các dung dịch phân tích.
9. Khảo sát độ tuyến tính của chất phân tích.
2.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký
a. Chọn detector
Paracetamol và Ibuprofen đều hấp thụ ánh sáng mạnh trong vùng tử ngoại (UV). Mặt khác detector PDA cho phép quan trắc các chất tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 500 nm trong cùng một phép đo. Đây là điểm ưu việt của detector PDA. Căn cứ vào những điều trên, tôi chọn detector phù hợp cho phép phân tích là detector PDA.
b. Chọn pha tĩnh
Pha tĩnh thông dụng nhất là silicagan có gắn gốc ankyl mạch dài, không phân cực, thông dụng nhất là -C18H37. Khoảng 61% các máy HPLC sử dụng loại cột chứa pha tĩnh này. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, tôi lựa chọn cột C18 với đường kính hạt pha tĩnh là 5 μm, chiều dài cột tách 250 mm, và
đường kính cột 6,1 mm để tìm các điểu kiện khác tối ưu hóa việc tách để xác định paracetamol và ibuprofen.
c. Lựa chọn dung môi
Căn cứ vào tính chất của paracetamol và ibuprofen cùng các tài liệu tham khảo. Tôi chọn dung dịch đệm phosphat (pH=6) làm dung môi cho quá trình nghiên cứu.
d. Lựa chọn pha động
Trong quá trình sắc ký, pha động được chọn như thế nào là tùy thuộc vào tính chất của mẫu phân tích hoặc nồng độ. Pha động có thể là dung môi đơn hay h n hợp nhiều dung môi được trộn theo tỉ lệ thích hợp. Khi chọn pha động cần chú ý đến một số yêu cầu sau:
-Trơ và không tác dụng hóa học với pha tĩnh. -Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc ký. -Hòa tan tốt h n hợp các chất phân tích. -Phù hợp với loại detector đã chọn.
Pha động là một yếu tố rất linh động, ta có thể dễ dàng thay đổi để thu được kết quả tách tốt nhất bằng cách thay đổi tỉ lệ thành phần các loại dung môi hữu cơ. Pha động có thể là hệ dung môi không phân cực hoặc hệ dung môi phân cực. người ta thường dùng nhất là hệ CH3OH - H2O hoặc hệ axetonitril - dung dịch đệm phosphat. Hệ sắc ký này có thể dùng để tách nhiều h n hợp từ phân cực đến không phân cực, vì vậy phạm vi sử dụng phong phú hơn. Trong các nghiên cứu gần đây, phương pháp sắc ký lỏng pha ngược HPLC sử dụng thành phần pha động gồm kênh A là đệm phosphat và kênh B là axetonitril được sử dụng rất hiệu quả trong việc phân tích đồng thời paracetamol và ibuprofen trong nhiều mẫu dược phẩm.
Do đó, tôi lựa chọn dung môi pha động gồm kênh A là đệm phosphat và kênh B là axetonitril để xác định đồng thời paracetamol và ibuprofen trong mẫu thuốc.
e. Khảo sát bước sóng hấp thụ quang của paracetamol và ibuprofen trên thiết bị HPLC
Trong nghiên cứu này, tôi chuẩn bị các dung dịch chuẩn paracetamol có nồng độ 325 ppm, dung dịch chuẩn ibuprofen có nồng độ 200ppm. Sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Do các chất trên hấp thụ ánh sáng mạnh trong vùng tử ngoại (UV). Tôi chọn detector PDA khảo sát tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 410 nm. Các điều kiện khác cố định không đổi gồm kênh A là dung dịch đệm phosphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 90:10 về thể tích, tốc độ dòng là 0,6 mL/phút để tiến hành quét phổ hấp thụ của dung dịch chứa các chất paracetamol và ibuprofen riêng rẽ từ bước sóng 200 nm đến 410 nm để tìm bước sóng tối ưu cho việc phân tích.
f. Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động.
Trong nghiên cứu này, tôi chuẩn bị một dung dịch mẫu giả chứa h n hợp paracetamol nồng độ 325ppm và ibuprofen nồng độ 200ppm. Sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Dựa trên tài liệu tham khảo, khi tăng tỷ lệ ACN thì thời gian lưu giữ các chất trên cột tăng, dẫn đến các chất có thể bị tách ra muộn gây doãn chân pic, ngược lại khi giảm tỷ lệ ACN thì thời gian lưu giữ các chất phân tích trên cột sắc ký giảm, các chất được tách ra sớm, chiều cao tăng tuy nhiên không tách được hoàn toàn các.
Dựa trên những điều tham khảo ở trên, tôi khảo sát hệ dung đôi pha động với tỷ lệ ACN trên dung dịch đệm phosphat theo các tỉ lệ 60:40; 30:70; 20:80 và 10:90 về thể tích. Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm tốc độ dòng là 0,6 mL/phút, detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng chất paracetamol 218nm và ibuprofen 247nm. Tiến hành khảo sát để tìm ra tỉ lệ tối ưu giữa ACN và dung dịch đệm phosphat.
g. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy
Trong nghiên cứu này, tôi chuẩn bị một dung dịch mẫu giả chứa h n hợp paracetamol có nồng độ 325ppm và ibuprofen có nồng độ 200(ppm). Sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi. Tôi tiến hành
khảo sát pha động ở các tốc độ là 0,6 mL/phút; 0,7mL/phút; 0,8mL/phút; 0,9mL/phút và 1mL/phút. Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm kênh A là dung dịch đệm phosphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 90:20 về thể tích, detector PDA với bước sóng từ 200nm đến 420nm.Tiến hành khảo sát để tìm ra tốc độ dòng chảy tối ưu cho phép phân tích.
Bảng 2.1. Các điều kiện tiến hành sắc ký
Điều kiện sắc ký Cụ thể
Máy HPLC Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - Acquity Arc
Detector PDA
Cột tách Cột C18 với đường kính hạt pha tĩnh là 5 μm, chiều dài cột tách 250 mm, và đường kính cột 6,1 mm
Dung môi Dung dịch đệm phosphat (pH=6)
Pha động Kênh A: dung dịch đệm phosphat (pH=6) Kênh B: dung dịch axetonitril.
Bước sóng hấp
thụ quang Khảo sát tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 410 nm. Tỉ lệ pha động
Khảo sát hệ dung môi pha động với tỷ lệ ACN trên dung dịch đệm photphat theo các tỉ lệ 60:40; 30:70; 20:80 và 10:90.
Tốc độ dòng Khảo sát pha động ở các tốc độ là 0,6mL/phút;
0,7mL/phút; 0,8 mL/phút; 0,9 mL/phút và 1,0 mL/phút.
h.Chọn thể tích vòng mẫu
Độ chính xác, độ đúng, lượng mẫu cần thiết nạp vào cột sắc ký không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu. Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể tích bơm mẫu vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng làm chân peak sắc ký doãng ra. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu quá lớn thì hiện
tượng doãng peak xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn peak trong quá trình tách. Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của peak sẽ tăng tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà vẫn tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao peak sắc ký sẽ không tăng nữa và lúc đó peak sắc ký sẽ tù, doãng chân và không sắc nét. Vì vậy việc lựa chọn thể tích cũng rất quan trọng. Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo nên peak có độ sắc nét cao và tránh doãng peak. Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 40, 50, 100 μl trong đó vòng mẫu 20 μl thường hay được sử dụng nhất. Trong đề tài này, để định lượng Paracetamol và Ibuprofen tôi chọn thể tích vòng mẫu là 20 μl phù hợp với thiết bị nạp mẫu (injector) 20 μl được trang bị trong phòng thí nghiệm.
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu theo phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử
- Tiến hành quét phổ từ 200 nm đến 900 nm để kiểm tra lại bước sóng hấp thụ quang cực đại của các dung dịch paracetamol và ibuprofen.
- Khảo sát khoảng tuyến tính của paracetamol và ibuprofen từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- Định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen trong các mẫu tự pha để xác định các sai số khi tỷ lệ hàm lượng paracetamol và ibuprofen khác nhau.
- Định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen trong mẫu thuốc. - Đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua xác định độ thu hồi.
2.3. Các đại lƣợng đặc trƣng để xử lý kết quả phân tích. 2.3.1. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp
- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
n n 2 2 i i i= 1 i= 1 -μ -C S = = k k C C (2.1) %RSD= .100 (%) C S (2.2)
Trong đó: Ci là các giá trị nồng độ (µg/mL) của dung dịch paracetamol và ibuprofen tính được lần thứ i; là giá trị nồng độ thực của mẫu; C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định; k là số bậc tự do (k=n-1).
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các h n hợp PARACETAMOL, CPM và B1 tự pha chế thông qua sai số tương đối RE. Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính toán được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức:
T i n h t o a n 0 0 C - C R E % = . 1 0 0 % C (2.3) Trong đó:
RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử. CTinh toan (µg/mL) là nồng độ tính toán được.
C0 (µg/mL) là nồng độ đã biết của dung dịch PARACETAMOL, CPM và B1 trong h n hợp.
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn. Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thức sau: CT-
R e = .1 0 0 % C K C v (2.4)
CT là nồng độ (µg/mL) của dung dịch PARACETAMOL, CPM và B1 xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn.
CK là nồng độ (µg/mL) của dung dịch PARACETAMOL, CPM và B1 xác định được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn.
C là nồng độ (µg/mL) của PARACETAMOL, CPM và B1 chuẩn thêm vào mẫu (đã biết).
2.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền. Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có công thức như sau:
3 .S D L O D =
B (2.5)
SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang. LOQ được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lượng với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95%, thông thường người ta sử dụng công thức:
1 0 .S D L O Q =
B (2.6)
2.3.3. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:
P ,k P ,k X t .S X ± ε = X ± X ± t .S n (2.7) Với tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 4 = 2,78; t0,95; 5 = 2,57).
X là giá trị trung bình của tập số liệu các kết quả nghiên cứu; S là độ lệch chuẩn, được tính theo công thức (2.1); n là số phép đo.
SX là độ lệch chuẩn của đại lượng trung bình
2.4. Dụng cụ và hóa chất. 2.4.1. Dụng cụ 2.4.1. Dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L-2000 với detector UV-Vis L-2420 của Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.
- Máy quang phổ UV – 1700 Shimadzu của Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm – 900 nm, có kết nối máy tính.
- Bộ cuvet thạch anh.
- Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g. - Máy rung siêu âm và máy đo pH.
- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [23]. - Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm...
- Bình định mức dung dịch: 10 mL; 25 mL; 50 mL; 100 mL; 1000mL. - Pipet các loại: 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; 25 mL.
- Màng lọc 0,45µm và một số dụng cụ khác.
2.4.2. Hóa chất
HCl, H2SO4, HNO3, H3PO4, Na2HPO4 dạng tinh thể,CH3CN, axetonitril... dùng để pha chế các dung dịch đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
Paracetamol chuẩn của merck độ tinh khiết > 97,5%
Ibuprofen chuẩn của merck độ tinh khiết > 98,8%
Dung dịch axetonitril của merck, dung dịch H3PO4 đặc.
Thuốc Dibulaxan do công ty cổ phần dược Danapah sản xuất, có thành phần paracetamol 325mg và ibuprofen 200mg. Số lô 050719, ngày sản xuất 10/08/2019, hạn sử dụng 10/08/2022
Thuốc Ibucapvic do công ty cổ phần dược phẩm trung ương Mediplatex sản xuất có thành phần paracetamol 325mg và ibuprofen 200mg. Số lô 204420, ngày sản xuất 18/01/2020, hạn sử dụng 17/01/2023
Thuốc Travicol do công ty cổ phần dược TV Pharma (Việt Nam) sản xuất, có thành phần paracetamol 500mg và ibuprofen 200mg. Số lô 041717, ngày sản xuất 15/01/2017, hạn sử dụng 14/01/2020.
2.5. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Dung môi pha mẫu
- Cân chính xác 3,5598g Na2HPO4 vào bình 1 lít, sau đó định mức thành 1000 mL bằng nước cất 2 lần. Dùng máy pH điều chỉnh pH = 6 bằng axit H3PO4 đặc nồng độ 85 % ta được dung dịch đệm phosphat có pH = 6.
Dung dịch chuẩn gốc:
- Dung dịch paracetamol chuẩn: Cân chính xác 0,100 g paracetamol cho vào bình định mức 100 mL sau đó cho thêm vào dung môi pha mẫu, rung siêu âm và định mức đến 100 mL. Ta được dung dịch vitamin B1 có nồng độ 1000 (ppm). Từ dung dịch này ta pha loãng ra các nồng độ 200 (ppm); 400 (ppm); 600 (ppm); 800 (ppm);
- Dung dịch B6 chuẩn: Cân chính xác 0,100 g ibuprofen cho vào bình định mức 100 mL sau đó cho thêm vào dung môi pha mẫu, rung siêu âm và định mức đến 100 mL. Ta được dung dịch ibuprofen có nồng độ 1000(ppm). Từ dung dịch này ta pha loãng ra các nồng độ 200 (ppm); 400(ppm); 600 (ppm); 800(ppm).
Dung dịch mẫu giả: pha từ các dung dịch chuẩn mẫu ở trên để được 2 mẫu giả:
+ Mẫu 1: dung dịch h n hợp paracetamol 325ppm và ibuprofen 200ppm. + Mẫu 2 : dung dịch h n hợp paracetamol 500ppm và ibuprofen 200ppm
Xử lí mẫu thuốc
-Nghiền nhỏ mẫu thuốc sau đó đem hòa vào 1000mL dd đệm,lắc đều, rung siêu âm, sau đó ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45 μm trước khi bơm vào hệ thống HPLC.
Dung môi pha động:
- Kênh A: Cân chính xác 3,5598g Na2HPO4 cho vào bình 1 lít, sau đó định mức thành 1000 mL bằng nước cất 2 lần. Dùng máy pH điều chỉnh pH = 6 bằng axit H3PO4 đặc nồng độ 85 % ta được dung dịch đệm phosphat có pH = 6. Dung dịch đệm phosphat trong bình 1000 mL được lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi đưa vào hệ thống HPLC.
- Kênh B: đưa vào kênh B của hệ thống máy HPLC dung dịch axetonnitril của merck.
2.6. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phƣơng pháp UV-Vis
Cân chính xác lần lượt là 50 mg paracetamol , ibuprofen cho vào hai bình định mức 100 mL khác nhau. Đem hòa tan và định mức bằng dung dịch HCl 0,1M, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút. Thu được các dung dịch paracetamol và ibuprofen có nồng độ là 500 µg/mL. Pha loãng các dung dịch trên thành các dung dịch có nồng độ là 50 µg/mL. Tiếp tục pha loãng các dung