Phân loại khoa học:
Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ : Enterobacteriales Họ : Enterobacteriaceae Chi : Escherichia Loài: E.coli
Hình 1.16. Hình dạng của vi khuẩn E.coli quan sát dưới kính hiển vi [25]
Đặc điểm:
Escherichia coli (E.coli) hay còn gọi là vi khuẩn đại tràng, là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của người và động vật máu nóng. Chúng được phát hiện đầu tiên vào năm 1885 do Escherich phát hiện, thuộc
họ vi khuẩn Enterobacteriaceae. Chúng là các trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình (2-3µm) x 0.5 µm. Trong những điều kiện không thích hợp vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ.
Chương 2
THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐẠC 2.1. Trang thiết bị, vật liệu và hóa chất sử dụng
2.1.1. Các dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
Máy khuấy từ gia nhiệt, cân phân tích 4 số GR-200, tủ sấy, máy ly tâm tốc độ cao. Bộ sưu tập các chủng vi khuẩn và box nuôi cấy vi khuẩn; các đĩa petri nuôi cấy vi khuẩn, nấm. Máy đo pH để bàn sension 3, máy đo quang phổ hấp thụ UV-Vis HITACHI U-2900 (Japan). Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope-TEM) JEM 1010 (Jeol). Phổ kế hồng ngoại Spectrum FTIR Affinity-1S (SHIMADZU). Máy đo phổ nhiễu xạ tia X.
2.1.2. Các hoá chất sử dụng
Các hóa chất sử dụng: Bạc nitrat (AgNO3, 99.8%), tác nhân khử mạnh Sodium Bohidrid (NaBH4) xuất sứ từ Đức; NaOH; axit nitric (HNO3) có độ tinh khiết cao; Trisodium citrate dihydrate (TSC) (𝐶6𝐻5𝑁𝑎3𝑂7· 2𝐻2𝑂, 99%) đóng vai trò vừa là chất khử vừa là tác nhân ổn định, mua của hãng Sigma Aldrich. Các hóa chất đều được pha bằng nước cất 2 lần và nước khử ion.
Các môi trường nuôi cấy: Nuôi cấy vi khuẩn E.coli.
2.2. Chế tạo các hạt keo nano bạc dạng cầu
2.2.1. Phương pháp khử hóa học sử dụng citrate
Đây là phương pháp mà sử dụng một bước để tổng hợp các hạt keo nano bạc với tác nhân khử là TSC. TSC ngoài việc đóng vai trò là tác nhân khử còn đóng vai trò là tác nhân ổn định để ngăn cản sự kết đám của hạt nano trong quá trình tổng hợp các hạt nano AgNPs. Quá trình tổng hợp được thực hiện như sau: Đầu tiên, dung dịch muối bạc AgNO3 có nồng độ 1mM được khuấy từ mạnh và gia nhiệt đến sôi. Tiếp theo, dung dịch TSC được thêm từng giọt vào bình đựng AgNO3 khi nhiệt độ trong bình phản ứng đã đạt 100oC. Quan sát thấy khi mầu của dung dịch chuyển sang hơi vàng nhạt, chứng tỏ đã xảy ra phản ứng khử ion Ag+. Ngừng các điều kiện phản ứng và để bình phản ứng nguội dần đến nhiệt độ phòng. Quá trình tạo thành hạt nano bạc được mô tả trên Hình 2.1.
Hình 2.1. Hình minh họa cơ chế phát triển mầm tạo thành các AgNPs
bằng phương pháp khử citrate.
Sơ đồ thí nghiệm được bố trí như Hình 2.2.
Hình 2.2. a) Thí nghiệm chế tạo hạt nano bạc.
b) Dung dịch hạt nano bạc sau khi chế tạo
Các mẫu sau khi chế tạo được bảo quản trong bóng tối và ở nhiệt độ 4oC. Một số tham số ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp hạt nano bạc được khảo sát nhằm tìm ra điều kiện tối ưu để ổn định hạt nano với hiệu suất cộng hưởng Plasmon cao. Phản ứng khử ion Ag+ theo tác giả Pillai Z.S và cộng sự [1] như sau;
Để khảo sát ảnh hưởng của 3 tham số (tỷ lệ mol TCS/AgNO3), thời gian phản ứng và pH), đối với mỗi thí nghiệm chỉ một tham số thay đổi còn các tham số khác được giữ nguyên.
2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng mẫu
Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của 3 tham số đối với quá trình tổng hợp các hạt nano bạc, ảnh hưởng cụ thể của từng tham số được trình bày cụ thể sau đây.
a) Ảnh hưởng của tỷ lệ mol TSC/AgNO3 lên AgNPs
Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của hàm lượng chất khử, tiến hành làm 7 thí nghiệm riêng rẽ, với tỷ lệ mol giữaTSC/AgNO3 lần lượt: 2:1; 3,5:1; 5:1; 8:1; 15:1; 20:1 và 35:1 và phản ứng được thực hiện trong 25 phút. Thí nghiệm các tỷ lệ này được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ TSC/AgNO3 đến quá trình tổng hợp các hạt keo nano bạc
Tên mẫu TSC (mol) AgNO3 (mol) Thời gian phản ứng (phút)
M1 2 1 3 M2 3,5 M3 5 M4 8 M5 15 M6 20 M7 35
b) Ảnh hưởng của thời gian tiêm TSC và thời gian phản ứng lên AgNPs
Thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian phản ứng được chuẩn bị 90ml AgNO3(10-3M) và 15ml TSC (5x10-3M). Tỷ lệ mol của TSC/AgNO3 là 5:1 được lựa chọn để nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên quá trình chế tạo các hạt nano bạc. Đầu tiên khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ bơm TSC vào dung dịch AgNO3 trong 2 trường hợp: Tiêm nhanh và tiêm chậm (từng giọt). Kết quả chi tiết sẽ được bàn luận trong chương 3. Thứ hai là, khảo sát ảnh hưởng của thời
gian phản ứng lên sự tạo thành hạt nano bạc. 7 mẫu với thời gian phản ứng khác nhau được khảo sát lần lượt: 4, 8, 14, 20, 25, 32 và 42 phút. Ở mỗi thời gian phản ứng này, 10 ml dung dịch keo hạt nano bạc được lấy ra và để nguội đến nhiệt độ phòng. Các thông số của thí nghiệm được trình bày tóm tắt trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tổng hợp các hạt keo nano bạc
Tên mẫu Tỷ lệ mol TSC/ AgNO3 Thời gian phản ứng (phút)
T1 5:1 4 T2 5:1 8 T3 5:1 14 T4 5:1 20 T5 5:1 25 T6 5:1 32 T7 5:1 42
c) Khảo sát sự ảnh hưởng của pH
Bảng 2.3. Các điều kiện thực nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của pH
Mẫu Tỷ lệ mol (TSC:AgNO3) Thời gian phản ứng (min) Thể tích mẫu[ml] HNO3 (30%) [µl] NaOH (0.3 M) [µl] pH P1 5:1 25 10 - - 7.3 P2 10 100 - 1.53 P3 10 30 - 2.1 P4 10 10 - 2.5 P5 10 - 20 10.3 P6 10 - 10 10 P7 10 - 5 9.6 P8 30 - 200 11.3
Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến tính chất quang của các hạt nano bạc AgNPs, pH của môi trường được điều chỉnh bằng axit nitric (HNO3) và natri
hydroxit (NaOH) vào dung dịch hạt nano bạc ở nhiệt độ phòng sau khi tổng hợp. Tỷ lệ mol của TSC/AgNO3 được chọn là 5:1, nhiệt độ phản ứng ở 100°C và thời gian phản ứng là 25 phút. Các thông số điều chỉnh pH của môi trường chứa AgNPs được trình bày trong bảng 2.3.
2.3. Chế tạo các hạt nano bạc dạng đĩa bằng cảm quang dùng LED
2.3.1. Quy trình
Quá trình chế tạo hạt nano bạc hình thù khác nhau bằng phương pháp quang hóa gồm có 2 bước cơ bản:
Bước 1: Tạo mầm
Lấy 50ml H2O cho vào bình cầu đã được làm sạch. Thêm 2ml AgNO3 (2,5 mM) + 4 ml TSC (2,5 mM). Cho bình cầu vào hộp xốp đá lạnh và khuấy từ trong thời gian 30 phút. Sau đó, nhỏ giọt từ từ 400l dung dịch NaBH4 (10 mM) đã được làm lạnh. Khuấy từ thêm 60 phút. Nhỏ từ từ 200l dung dịch NaOH (10 mM) và khuấy từ thêm 15 phút. Sơ đồ tạo mầm được thể hiện ở Hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ chế tạo mầm Ag
Bước 2: Phát triển mầm để tạo các đĩa AgNPs bằng chiếu LED
Dung dịch mầm nano bạc sau khi tạo ra sẽ được chiếu bằng hệ thống LED (532 nm) trong những khoảng thời gian cần khảo sát ở nhiệt độ phòng. Hình 2.4 là ảnh chụp thí nghiệm các hạt nano bạc được chiếu sáng bởi LED với công suất 0,51 mW/cm2.
Hình 2.4. Phát triển mầm bằng đèn LED với mật độ công suất 0,51 mW/cm2 2.3.2. Ảnh hưởng của lượng TSC lên các đĩa AgNPs
Để nghiên cứu ảnh hưởng của lượng citrate lên sự tạo thành đĩa AgNPs dưới kích thích của LED, đề tài tiến hành khảo sát thay đổi lượng TSC ngay trong quá trình tạo mầm. Các thông số thay đổi TSC được trình bày như trong bảng 2.4. Trong trường hợp này tỷ số nồng độ [NaBH4]/[AgNO3] được chọn cố định bằng 5:4. Sự ảnh hưởng chi tiết của TSC sẽ được trình bày chi tiết trong chương 3.
Bảng 2.4. Bảng số liệu thay đổi lượng TSC lên sự tạo thành mầm
Stt Mẫu [NaBH4]/[AgNO3] TSC (2,5mM) (µl) 1 E1 5:4 50 2 E2 100 3 E3 500 4 E4 1000 5 E5 2500 6 E6 4000
2.4. Khảo sát tính kháng khuẩn của hạt keo nano bạc với khuẩn E.coli
Các mẫu nano bạc chế tạo được ở trên đem thử nghiệm kháng khuẩn với chủng vi khuẩn Gram âm-vi khuẩn E.coli. Các thí nghiệm được tiến hành trên đĩa Petri đã được khử trùng. Phương pháp đục lỗ được sử dụng để xác định đường kính vô khuẩn bởi đây là phương pháp dễ thực hiện và phù hợp với điều kiện trong phòng thí nghiệm. Các bước tiến hành thí nghiệm:
Cho 3 ml môi trường nuôi dưỡng được đổ vào các đĩa Petri vô trùng (như một lớp cơ bản). Lấy 15 μL dịch huyền phù của chủng vi khuẩn để thử nghiệm có số lượng khoảng 79 tế bào nhỏ trên bề mặt của môi trường của đĩa và trải đều trên bề mặt đến khi khô bằng que trang thủy tinh vô trùng.
Hình 2.5. Hình ảnh đĩa Petri được đục lỗ để làm thí nghiệm thử kháng khuẩn
2.5. Các phương pháp khảo sát
2.5.1. Phổ hấp thụ UV-Vis
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có cường độ I0vào môi trường vật chất có bề dày 1(cm) và nồng độ C(mol/l), thì chùm tia này sẽ bị môi trường vật chất hấp thụ và truyền qua. Cường độ I của chùm tia truyền qua môi trường này bị giảm theo quy luật Lamber-Beer:
𝐿𝑜𝑔 (𝐼0
𝐼) = 𝐾. 𝑛 (2.1)
Hay: log (𝐼0
𝐼) = 𝜀1𝐶 (2.2)
Trong đó: 𝐾: là hệ số hấp thụ mol hay độ hấp thụ của môi trường, 𝑛: là số mol chất nghiên cứu đặt trên đường đi của bức xạ.
Đại lượng log(I0/I ) được gọi là mật độ quang (D) hoặc độ hấp thụ (A).
𝜀 là hệ số hấp thụ mol (hệ số mol) có giá trị bằng mật độ quang của dung dịch khi nồng độ chất hấp thụ bằng một đơn vị và độ dầy chất hấp thụ bằng một đơn vị. Hệ số hấp thụ chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ và bước sóng của bức xạ bị hấp thụ. Độ truyền qua của môi trường T=I /I0.
Hình 2.6. Biểu diễn định luật Lamber-Beer
Không một chất nào lại hấp thụ trong toàn bộ các vùng phổ điện từ. Sự hấp thụ thường tập trung vào từng vùng phổ hẹp, cho nên để thuận lợi, người ta thường biểu diễn và xem xét từng vùng phổ riêng biệt như: vùng tử ngoại, khả kiến, hồng ngoại…
Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ Kνvào tần số hoặc bước sóng gọi là đường cong hấp thụ (hay phổ hấp thụ). Mỗi chất hấp thụ đều hấp thụ lọc lựa ở những tần số bước sóng khác nhau.
Phương trình (2.1) là biểu thức toán học của định luật Beer-Lamber: khi hấp thụ tia đơn sắc, độ hấp thụ phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ chất hấp thụ. Tùy từng chất, định luật Beer-Lamber thường đúng trong một khoảng nồng độ.
Hình 2.7. Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ UV-Vis hai chùm tia
Đối với các dung dịch nano kim loại nói chung và nano bạc nói riêng thì việc phân tích phổ hấp thụ UV-Vis (hay còn gọi là phổ hấp thụ Plasmon) cho các thông tin quan trọng về tính chất quang của chúng.
Nguồn bức xạ Dung dịch mẫu Bộ dò bức xạ
Hình 2.4 trình bày sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang hai chùm tia. Ánh sáng tới được tách thành các bước sóng đơn sắc nhờ cách tử nhiễu xạ. Tiếp đó, chùm sáng đơn sắc được chia thành hai tia có cường độ bằng nhau nhờ gương bán phản xạ. Một trong hai tia sáng truyền qua cuvet thạch anh chứa dung dịch mẫu cần nghiên cứu, có cường độ I sau khi truyền qua mẫu. Tia còn lại truyền qua cuvet tương tự chứa dung môi để so sánh. Cường độ của tia sáng sau khi truyền qua mẫu so sánh là I0. Việc quay cách tử và tự động so sánh cường độ các tia sáng sau khi truyền qua dung dịch chứa mẫu nghiên cứu và mẫu dung môi sẽ cho phép nhận được phổ hấp thụ của mẫu nghiên cứu dưới dạng sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào bước sóng.
Các dung dịch chứa keo nano bạc được đo trên thiết bị UV-Vis hai chùm tia Jasco V530 tại Khoa Môi Trường và Trái Đất-Trường Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên. Thiết bị này cho phép đo phổ từ 200nm đến 1100nm.
2.5.2. Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope −TEM) −TEM)
Đối với hạt nano bạc kích thước nanomet, chúng tôi sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua để xác định hình dạng, kích thước của mẫu. Kính hiển vi điện tử truyền qua có ưu điểm nổi bật: nhờ bước sóng của chùm điện tử ngắn hơn rất nhiều so với ánh sáng nhìn thấy nên nó có thể quan sát tới kích cỡ 0,2 nm. Hơn nữa, việc xác định hình dạng và kích thước của hạt nano bạc cũng rất quan trọng. Vì vậy việc sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua là cần thiết.
Kính hiển vi điện tử truyền qua (tiếng Anh: transmission electron
microscopy, viết tắt: TEM) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng
chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên fim quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số.
Nguyên lý hoạt động:
Kính hiển vi điện tử truyền qua làm việc theo nguyên tắc phóng đại nhờ các thấu kính, ánh sáng tới là tia điện tử có bước sóng ngắn cỡ 0,05 Å và thấu kính
thường là các thấu kính điện tử có tiêu cự f thay đổi được. Chùm tia điện tử phát ra từ súng điện tử được gia tốc với điện thế tăng tốc (80 kV), qua một số kính hội tụ và chiếu lên mẫu. Kính vật tạo ra ảnh trung gian và kính phóng sẽ phóng đại ảnh trung gian thành ảnh cuối cùng với độ phóng đại M = Mv∗ Mp.
Hiện nay, năng suất phân giải của kính hiển vi điện tử truyền qua không bị giới hạn. Phương pháp này có độ phân giải cỡ 2-3Å. Một nhược điểm cơ bản của kính hiển vi điện tử truyền qua là các mẫu nghiên cứu phải được xử lý thành các lát rất mỏng (< 0.1 mm), hoặc tạo thành các dung dịch để nhỏ lên các tấm lưới bằng đồng mà đã được trải một lớp màng Cacbon, các hạt nano tinh thể sẽ mắc trên các lưới đỡ này khi đo dưới kính hiển vi điện tử. Các lớp này phải đủ dày để tồn tại ở dạng rắn, ít nhất là vài chục đến vài trăm lớp nguyên tử. Như vậy ứng với mỗi điểm trên ảnh hiển vi điện tử truyền qua là những cột điện tử mẫu (chiều cao của cột nguyên tử là chiều dày trên mẫu). Việc quan sát chi tiết của vật rắn như: lệch mạng, các sai hỏng,…được giải thích theo cơ chế tương phản nhiễu xạ. Nguyên lý hoạt động của TEM được minh họa trong Hình 2.8.
Hình 2.8. Sơ đồ khối kính hiển vi điện tử truyền qua
Cơ chế tương phản nhiễu xạ ở ảnh TEM: Điện tử đi vào mẫu gặp các nguyên tử, bị tán xạ, nguyên tử số Z của mẫu càng lớn, phần tán xạ càng mạnh, phần truyền thẳng càng yếu. Mặt khác, khi điện tử đi qua chỗ dày gặp nhiều nguyên tử hơn là đi qua chỗ mỏng. Một trong những ưu điểm của TEM là có thể dễ dàng điều khiển thay đổi tiêu cự (bằng cách thay đổi dòng điện kích thích vào thấu kính) nên có thể thay đổi tiêu cự của kính phóng để trên màn có ảnh hiển vi
hay ảnh nhiễu xạ, nhờ đó mà kết hợp biết được nhiều thông tin về cấu trúc, cách sắp xếp các nguyên tử của mẫu nghiên cứu. Hơn nữa, có thể dùng diafram đặt ở vị trí thích hợp để che bớt các tia tán xạ, chỉ lấy các tia đi giữa, đó là cách tạo ảnh trường sáng BF (Bright Field) thông thường.
Kính hiển vi điện tử truyền qua cho phép quan sát được nhiều chi tiết nano