tỏch dũng
Để tiến hành xỏc định genotype HPV từ những mẫu cú HPV DNA dương tớnh với mồi GP5+/GP6+ original và GP5+/GP6+ modified nhưng chưa xỏc định được genotype bằng kỹ thuật DNA micoroarray, chỳng tụi tiến hành dũng húa sản phẩm PCR với mục đớch tăng số lượng DNA từ sản phẩm PCR và để chọn lọc những sản phẩm DNA đớch đảm bảo chất lượng. Sau dũng húa, những DNA plasmid tinh sạch sẽ được chọn lọc để xỏc định trỡnh tự nucleotide.
Trong một số nghiờn cứu trước, genotype HPV thường được xỏc định bằng phương phỏp lai trực tiếp với cỏc mẫu dũ oligonucleotid đặc hiệu hoặc bằng phương phỏp giải trỡnh tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại DNA HPV sau phản ứng PCR. Mặc dự, những phương phỏp này tiến hành nhanh chúng, thuận tiện nhưng hạn chế trong việc nhận định và phõn tớch kết quả xỏc định genotype HPV. Phương phỏp giải trỡnh tự gen trực tiếp sẽ hạn chế xỏc định trường hợp đa nhiễm genotype HPV và phương phỏp lai trực tiếp chỉ xỏc định được một số lượng hạn chế cỏc genotype HPV đó được gắn sẵn oligonucleotid. Hơn nữa, phương phỏp lai trực tiếp cũn cú thể xảy ra hiện
tượng lai chộo giữa cỏc mẫu dũ oligonucleotid với cỏc sản phẩm DNA HPV đứt góy hoặc khuếch đại khụng đặc hiệu [98]. Ngược lại, phương phỏp giải trỡnh tự gen sau tỏch dũng khụng chỉ xỏc định được cỏc mẫu đa nhiễm genotype mà cũn xỏc định riờng biệt từng genotype HPV.
Trỡnh tự nucleotide trong mẫu nghiờn cứu của chỳng tụi được xỏc định rừ ràng, khụng cú hiện tượng chồng lặp cỏc nucleotide. Khi so sỏnh những trỡnh tự thu được với trỡnh tự gen L1 trờn Ngõn hàng gen Quốc tế nhằm xỏc định genotype HPV, chỳng tụi nhận thấy cỏc genotype HPV trong mẫu nghiờn cứu của chỳng tụi cú độ tương đồng cao với cỏc trỡnh tự đó cụng bố.
Trờn tổng số 17 mẫu giải trỡnh tự nucleotide sau tỏch dũng, chỳng tụi xỏc định được 7 genotype HPV khỏc nhau khỏc nhau của 16 mẫu và 1 mẫu đó xỏc định được trỡnh tự đoạn gen 140 bp khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng mồi GP5+/GP6+ original khụng phải là HPV DNA. Với kết quả này, cú thể nhận xột rằng, mồi GP5+/GP6+ original và GP5+/GP6+ modified mà chỳng tụi sử dụng trong nghiờn cứu cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiờn, mồi GP5+/GP6+ original cú thể gõy bắt cặp nhầm và việc sử dụng mồi GP5+/GP6+ modified bổ xung nhằm xỏc định tỷ lệ nhiễm HPV trong nghiờn cứu là hợp lý.
Theo tỏc giả de Roda Husman, mồi GP5+/GP6+ original được sử dụng trong nghiờn cứu này cú độ nhạy rất cao, cú khả năng phỏt hiện được ớt nhất 27 genotype HPV khỏc nhau và đó được xỏc định là cặp mồi cú khả năng khuếch đại 100% DNA HPV đớch trờn bệnh nhõn UTCTC [59]. Do đú, cú thể sử dụng mồi GP5+/GP6+ original trong sàng lọc DNA HPV. Tuy nhiờn, khi so sỏnh độ nhạy và độ đặc hiệu của GP5+/GP6+ original với kỹ thuật đỏnh dấu phúng xạ mẫu dũ phỏt hiện HPV bằng kỹ thuật ELISA cho thấy phản ứng PCR sử dụng mồi GP5+/GP6+ original cú độ nhạy cao nhưng sản phẩm PCR
đụi khi cú xuất hiện sản phẩm phụ và hạn chế khả năng phỏt hiện một số genotype HPV khỏc như HPV-39 và HPV-52 [59].
Để khắc phục nhược điểm của mồi GP5+/GP6+ original, nhúm nghiờn cứu chỳng tụi tiến hành thiết kế mồi GP5+/GP6+ modified dựa trờn trỡnh tự nucleotide mồi GP5+/GP6+ original nhằm khuếch đại 140 bp của DNA đớch nằm trờn vựng gen L1, vựng gen bảo tồn và ổn định nhất trong bộ gen của HPV. Mồi GP5+/GP6+ modifile gồm 3 cặp mồi khỏc nhau được đỏnh dấu gồm GP5+M1-2; GP5+M2-2; GP5+M3-2 và GP6+M1-2; GP6+M2-2; GP6+M3. Chiều dài và trỡnh tự cỏc nucleotide mồi được trỡnh bày cụ thể trong bảng 2.1. chương 2. Đồng thời, độ đặc hiệu của mồi GP5+/GP6+ original và GP5+/GP6+ modified đó được nhúm nghiờn cứu cụng bố năm 2009 bởi tỏc giả Miyashita [17].
100% cỏc genotype HPV được phỏt hiện bằng phương phỏp giải trỡnh tự sau tỏch dũng là cỏc genotype HPV “nguy cơ thấp” hoặc “chưa xỏc định nguy cơ” khụng cú trỡnh tự oligonucleotide trờn mẫu dũ của Kit GeneSquare HPV Typing DNA microarray. Trỡnh tự oligonucleotide gắn trờn mẫu dũ chỉ gồm những trỡnh tự DNA bổ xung với đoạn gen L1 HPV của 15 genotype “nguy cơ cao” và 8 genotype “nguy cơ thấp” thường gặp nhất. Như vậy, phương phỏp giải trỡnh tự gen sử dụng trong nghiờn cứu là phương phỏp thớch hợp nhằm xỏc định bổ xung cỏc genotype HPV chưa cú oligonucleotide lai trờn mẫu dũ và giỳp phỏt hiện cỏc biến thể mới của genotype.
4.2.2. Sự phõn bố và tỡnh trạng đơn đa nhiễm genotype HPV
4.2.2.1. Sự phõn bố genotype HPV
HPV là một trong những vi rỳt cú nhiều genotype nhất với khoảng 200 genotype khỏc nhau được biết đến nhưng mới xỏc định trỡnh tự của khoảng 100 genotype, trong đú cú khoảng 40 genotype cú thể lõy truyền qua đường tỡnh dục. HPV 16, 18, 45, 31, 33, 52, 58, 35 là tỏm type “nguy cơ cao” thường gặp nhất chiếm tới 90% cỏc trường hợp UTCTC, riờng HPV 16 và HPV 18 đó
gặp ở 70% trường hợp [16], [60]. Trong tổng số 291 triệu phụ nữ trờn toàn thế giới nhiễm HPV, cú khoảng 105 triệu trường hợp nhiễm type HPV “nguy cơ cao” 16, 18 [16].
Hiện nay, vắc xin đặc hiệu type 16, 18 đó gúp phần đỏng kể trong cụng tỏc phũng chống gỏnh nặng bệnh tật do UTCTC gõy ra cho cộng đồng. Tuy nhiờn, khả năng bảo vệ chộo giữa cỏc type HPV của vắc xin rất thấp, dưới 1% trong khi đú, sự phõn bố genotype HPV thay đổi theo từng vựng địa lý và sắc tộc khỏc nhau do cú sự tương tỏc giữa cỏc type và cỏc biến thể với đỏp ứng miễn dịch trong tế bào vật chủ [99]. Do đú, việc phỏt hiện DNA HPV và đỏnh giỏ sự phõn bố genotype HPV khụng chỉ cú ý nghĩa giỳp cho chương trỡnh triển khai vắc xin hiệu quả mà cũn cú ý nghĩa thiết thực trong việc quản lý, theo dừi, phũng ngừa sớm UTCTC cho đối tượng nhiễm HPV.
Từ 246 mẫu HPV DNA dương tớnh khi khuếch đại bằng phản ứng PCR với mồi GP5+/GP6+ original và 245mẫu HPV DNA dương tớnh khi khuếch đại bằng phản ứng PCR với mồi GP5+/GP6+ modified, chỳng tụi tiến hành xỏc định genotype HPV bằng phương phỏp DNA microarray và bằng phương phỏp giải trỡnh tự gen sau tỏch dũng. Kết quả nghiờn cứu đó xỏc định được 33 genotype từ 630 chủng HPV khỏc nhau, trong đú, cỏc genotype HPV “nguy cơ cao” chiếm đa số (75,87%), genotype “nguy cơ thấp” chiếm 16,5% và genotype “chưa xỏc định nguy cơ” chiếm 7,63%.
Tỡnh trạng lưu hành cỏc genotype nhúm “nguy cơ cao” phổ biến hơn cỏc genotype thuộc nhúm “nguy cơ thấp” cú lẽ vỡ những genotype “nguy cơ cao” thường khú bị loại bỏ khỏi cơ thể và được tồn tại dai dẳng hơn so với cỏc genotype “nguy cơ thấp” đặc biệt là HPV [16].
Với 33 genotype HPV được xỏc định từ 479 gỏi mại dõm tại Hải Phũng trong nghiờn cứu, chỳng tụi xỏc định sự phõn bố của HPV 52 là genotype
chiếm tỷ lệ cao nhất (13,33%), tiếp đến là HPV 16 (12,53%) và HPV 58 chiếm 8,09%. HPV 18 chiếm 6,5% tổng số genotype HPV xỏc định được.
Theo kết quả bỏo cỏo tổng hợp của de Sanjose và cộng sự năm 2007 về sự phõn bố genotype HPV ở phụ nữ cú tế bào học cổ tử cung bỡnh thường trờn toàn thế giới, HPV 16, HPV18, HPV 31và HPV 52 là những genotype thường gặp nhất chiếm 50% số người nhiễm HPV với tỷ lệ lần lượt là 2,5%; 0,9%; 0,7%; 0,6% và 0,6%. Nghiờn cứu tổng hợp từ 194 nghiờn cứu khỏc nhau về sự phõn bố genotype HPV trờn 1.016.719 phụ nữ trờn khắp thế giới, tỏc giả Bruni và cộng sự cụng bố tỷ lệ nhiễm HPV tương tự như nghiờn cứu trước trong đú HPV 16 (3,2%), HPV 18 (1,4%), HPV 52 (0,9%), HPV 31 (0,8%) và HPV 58 (0,7%) [16], [61].
Tuy nhiờn, genotype HPV phõn bố khụng giống nhau giữa cỏc khu vực. Ở chõu Âu và chõu Mỹ, HPV 16 và HPV 18 là hai genotype thường gặp nhất, tiếp đến là HPV 31 và HPV 33. Ở phớa Nam sa mạc Sahara, Chõu Phi, HPV 45 là genotype chiếm tỷ lệ cao nhất [16]. Trong khi đú, tại một số nước chõu Á như Nhật Bản, Philippine, Đài Loan và tỉnh Chiết Giang phớa Nam Trung Quốc, HPV 52 và HPV 58 lại là hai genotype thường gặp nhất [15] [18], [17], [42]. Như vậy, kết quả xỏc định sự phõn bố genotype HPV trong nghiờn cứu này cũng cho thấy sự phõn bố genotype HPV thay đổi theo từng vựng địa lý và sự phõn bố genotype HPV trờn đối tượng gỏi mại dõm tại Hải Phũng tương đồng với sự phõn bố genotype HPV tại cỏc tỉnh phớa Nam Trung Quốc và với một số nước lõn cận tại chõu Á.
So sỏnh với một số kết quả nghiờn cứu về sự phõn bố genotype HPV tại Việt Nam cho thấy, kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cú sự khỏc biệt với kết quả xỏc định sự phõn bố genotype HPV bằng phương phỏp PCR sử dụng mồi GP5+/GP6+ original và bằng phương phỏp enzyme miễn dịch (enzyme immunoassay) của tỏc giả Phạm Thị Hoàng Anh và cộng sự năm 2003,
nghiờn cứu trờn 994 phụ nữ độ tuổi từ 15 đến 65 tại khu vực Miền Bắc và 922 phụ nữ tại Thành phố Hồ Chớ Minh Miền Nam Việt Nam xỏc định HPV 16 là genotype chiếm tỷ lệ cao nhất, tiếp đến là HPV 58, 18 và HPV 56 [66]. Tuy nhiờn, kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi tương đồng với kết quả nghiờn cứu của tỏc giả Hernadez năm 2008, nghiờn cứu xỏc định sự phõn bố genotype HPV trờn 282 gỏi mại dõm tại tỉnh Súc Trăng, miền Nam Việt Nam bằng phương phỏp Reverse line blot detection sử dụng sản phẩm PCR khuếch đại bằng mồi GPMY09/GPMY11 (Roche Molecular Systems), kết quả bỏo cỏo HPV 52 là genotype phổ biến nhất. Sự khỏc biệt về kết quả nghiờn cứu sự phõn bố genotype HPV trờn cựng khu vực địa lý cú thể do việc sử dụng cỏc phương phỏp khỏc nhau trong nghiờn cứu.
Trong cỏc nghiờn cứu trước, cặp mồi được sử dụng nhiều nhất là GPMY09/GPMY11 khuếch đại 450 bp trờn đoạn L1 ORF và cặp mồi GP5+/GP6+original khuếch đại 140 bp vựng L1. Hai loại mồi đều cú độ nhạy cao, cú thể khuếch đại từ 10-200 bản copy DNA ,tuy nhiờn, nhược điểm của cả hai loại mồi GPMY09/GPMY11 và GP5+/GP6+ original đều cú nhiệt độ bắt cặp thấp cú thể gõy khuếch đại những mẫu DNA đứt góy hoặc DNA khụng đặc hiệu DNA đớch [100]. GPMY09/GPMY11 cú thể xỏc định sai lệch 7% UTCTC do sự vắng mặt của HPV DNA trong tế bào ung thư (DNA HPV đó bị đứt góy và làm mất vựng L1 ORF trong tế bào ung thư) [101].
Hiện nay, trờn thế giới cú hai loại vắc xin phũng chống HPV được sử dụng phổ biến là Gadasilđ (đặc hiệu HPV type 6,11,16,18; sử dụng cho nữ 9- 26 tuổi và cho nam 11-26 tuổi chưa từng quan hệ tỡnh dục) và Cervarixđ (đặc hiệu HPV type 16,18; sử dụng cho nữ từ 10 đến 45 tuổi). Vắc xin HPV là cỏc hạt vi rỳt cú cấu trỳc giống HPV nhưng khụng cú DNA HPV mà chỉ cú vỏ capsid với cỏc khỏng nguyờn L1, L2 trờn bề mặt (virus-particles, VLPs).
Cú rất nhiều cõu hỏi khỏc nhau hướng tới vai trũ của vắc xin đối với nhúm phụ nữ trẻ trong cộng đồng. Khi so sỏnh khả năng sinh khỏng thể của vắc xin HPV với đỏp ứng miễn dịch tự nhiờn của cơ thể sau nhiễm HPV cho thấy, việc tiờm phũng HPV bằng vắc xin giỳp cơ thể cú miễn dịch sinh khỏng thể mạnh mẽ gấp 50 lần so với đỏp ứng miễn dich tự nhiờn [102]. Theo kết quả nghiờn cứu đỏnh giỏ hiệu quả của vắc xin phũng nhiễm HPV trờn 8093 phụ nữ trẻ độ tuổi từ 15-25 sau 6 thỏng tiờm phũng của tỏc giả Paavonen và cộng sự năm 2009 cho thấy, hiệu quả phũng nhiễm HPV 16/18 đạt 92,9% , Cervarix kớch thớch cơ thể sinh đỏp ứng mạnh hơn so với Gardasil và việc tiờm phũng vắc xin cho nhúm phụ nữ trẻ tuổi cú vai trũ giảm nguy cơ UTCTC trong 4 năm sau đú. Gardasil cú khả năng bảo vệ cơ thể khỏi HPV 16 trong 8,5 năm sau tiờm phũng [103]. Theo kết quả nghiờn cứu tổng hợp từ 79 nghiờn cứu khỏc nhau của Bao và cộng sự năm 2008 về sự phõn bố genotype HPV nhằm đỏnh giỏ hiệu quả vắc xin phũng chống HPV 16/18 trờn 16,803 phụ nữ chõu Á cú xột nghiệm tế bào học cổ tử cung bỡnh thường và 8350 phụ nữ mắc UTCTC cho thấy, vắc xin phũng nhiễm HPV 16/18 cú thể bao phủ được khoảng 70% khu vực chõu Á. Tuy nhiờn, HPV 52 và HPV 58 là hai genotype chiếm tỷ lệ cao nhất ở khu vực Đụng Á và Đụng Nam Á [14]. Như vậy, kết quả sự phõn bố genotype HPV trong nghiờn cứu của chỳng tụi phản ỏnh sự tương đồng với kết quả nghiờn cứu trờn và việc triển khai vắc xin thế hệ hai (second-generation HPV prophylactic vaccine) phũng chống HPV 16, 52, 58, 18 ở khu vực Đụng Nam Á núi chung và tại Việt Nam núi riờng cú ý nghĩa quan trọng trong phũng trỏnh UTCTC cho cộng đồng, đồng thời, việc phỏt hiện cỏc genotype HPV nhúm “nguy cơ cao” gồm HPV 16, 18, 58, 52 được coi như chiến lược toàn diện trong việc triển khai vắc xin phũng chống HPV.
HPV genotype “nguy cơ cao” là tỏc nhõn cần thiết gõy biến đổi tế bào, hỡnh thành khối u ỏc tớnh, đặc biệt ở những trường hợp nhiễm dai dẳng kộo dài. Tuy nhiờn, vai trũ tỏc động của đa nhiễm genotype HPV với sự tăng sinh loạn sản tế bào vẫn cũn là vấn đề chưa được đỏnh giỏ rừ ràng.
Tỡnh trạng đa nhiễm genotype HPV thường gặp ở những người trẻ tuổi và những người bị suy giảm miễn dịch. Đa nhiễm với nhiều loại HPV là một phỏt hiện chung của nhiều nghiờn cứu dịch tễ học phõn tử, chiếm khoảng 20 – 50% tổng số cỏc trường hợp nhiễm HPV và là cơ hội cho tỡnh trạng nhiễm dai dẳng của cỏc genotype HPV, đặc biệt cỏc genotype “nguy cơ cao” [104]. Một số genotype HPV cú thể tương tỏc hoặc phối hợp hiệu quả với cỏc genotype khỏc để kớch thớch phỏt triển những biến đổi tế bào, hỡnh thành và tiến triển tổn thương.
Nguy cơ loạn sản mạnh mẽ và UTCTC xõm lấn dường như được tăng lờn đỏng kể ở những phụ nữ đa nhiễm nhiều genotype HPV so với những trường hợp đơn nhiễm một genotype HPV duy nhất [105]. Herrero và cỏc cộng sự đó chỉ ra nguy cơ tổn thương nội biểu mụ gai mức độ thấp tăng lờn khi cú hiện tượng đa nhiễm HPV 16 và cỏc genotype khỏc [106]. Hơn nữa, Fife và cộng sự cho rằng những genotype HPV cựng loài sẽ cú tương tỏc về đặc tớnh sinh học trờn tế bào đớch, HPV 51, 52, 56, và 58 là một trong những genotype cú tỏc dụng hiệp đồng với HPV-16 gõy loạn sản tế bào hoặc hỡnh thành ung thư [107].
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi xỏc định tỷ lệ đa nhiễm trờn đối tượng gỏi mại dõm tại Hải Phũng chiếm đa số (67,89%) trong đú, tất cả cỏc trường hợp đa nhiễm đều nhiễm ớt nhất một HPVgenotype “nguy cơ cao”. Theo bỏo cỏo của tổ chức Y tế thế giới về tỡnh hỡnh nhiễm HPV tại Việt Nam cho biết, tỷ lệ nhiễm chung trờn toàn quốc chiếm 5,4% [1], trong đú cú 41,6% số trường hợp đa nhiễm với ớt nhất hai genotype HPV. Như vậy, Việt Nam cú tỷ
lệ nhiễm HPV thấp hơn so với tỷ lệ nhiễm chung ở cỏc khu vực khỏc trờn thế