và phương phỏp giải trỡnh tự sau tỏch dũng
4.2.1.1. Xỏc định genotype HPV bằng phương phỏp DNA microarray microarray
Cú rất nhiều loại kit dựa trờn cỏc phương phỏp khỏc nhau được ứng dụng để phỏt hiện DNA HPV và xỏc định genotype HPV. Tuy nhiờn, độ nhạy và độ đặc hiệu của từng loại kit khụng giống nhau, đõy là một trong những nguyờn nhõn dẫn đến cỏc kết quả khỏc nhau về tỷ lệ nhiễm và sự phõn bố genotype HPV giữa cỏc khu vực [94]. Vỡ vậy, việc lựa chọn kit sử dụng trong nghiờn cứu cũng là vấn đề cần được quan tõm.
Cựng với sự phỏt triển của khoa học cụng nghệ, kỹ thuật sinh học phõn tử hiện đang là phương phỏp hữu hiệu trong chẩn đoỏn ứng dụng, trong đú cụng nghệ sử dụng DNA chớp (phương phỏp DNA microarray) hiện đang là phương phỏp tiờn tiến được ứng dụng hiệu quả nhất. Phương phỏp DNA microarray ứng dụng trong xỏc định genotype HPV khụng chỉ cú giỏ trị cao trong việc phỏt hiện đồng thời một số lượng lớn genotype HPV riờng biệt mà cũn cú khả năng phỏt hiện đa nhiễm cỏc genotype HPV với độ nhạy của kỹ thuật đạt 94,9% [95]. Hơn nữa, DNA microarray cũn được sử dụng nhằm đỏnh giỏ những thay đổi trong mức độ biểu hiện gen như cỏc biểu hiện đơn, đa hỡnh thỏi hoặc cỏc trỡnh tự đột biến trờn gen. Theo kết quả của tỏc giả Jones nghiờn cứu so sỏnh giữa phương phỏp DNA microarray với phương phỏp lai bắt giữ 2 và với phương phỏp PCR enzym miễn dịch sử dụng mồi GP5+/GP6+ cho thấy phương phỏp DNA microarray cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với hai phương phỏp trờn [96].
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi lựa chọn GeneSquare assay Kit (Kurabo, Osaka, Japan) để xỏc định genotype HPV dựa trờn kỹ thuật DNA microarray. Chất lượng của GeneSquare assay Kit đó được kiểm tra và so sỏnh với hai loại kit phổ biến khỏc như Digene Hybrid Capture II Assay (Valencia, CA) và Roche Linear Array HPV Genotyping Assay (Indianapolis, IN). Theo bỏo cỏo của tỏc giả Ermel và cộng sự năm 2010, GeneSquare assay Kit cú độ nhạy và độ đặc hiệu tương đồng với Roche Linear Array HPV
Genotyping Assay, nhưng cao hơn so với Digene Hybrid Capture II Assay. Tuy nhiờn, khi so sỏnh kết quả xỏc định genotype của Linear Array HPV Genotyping Assay và GeneSquare assay cho thấy, Linear Array HPV Genotyping Assay cú thể xỏc định thiếu một số genotype mà GeneSquare assay cú thể phỏt hiện được. Nguyờn nhõn là do mồi Linear Array HPV Genotyping Assay khụng thể khuếch đại đoạn L1 HPV đó bị mất hoặc đứt góy trong khi đú, mồi sử dụng trong GeneSquare assay Kit được thiết kế đặc hiệu khụng cú đoạn trựng lặp ở vựng khuếch đại, thay đổi từ 130 - 492 bp tựy theo từng genotype. Hơn nữa, GeneSquare assay Kit cũn cú khả năng phỏt hiện HPV genotype 52 cao hơn so với Roche Linear Array HPV Genotyping Assay. Thời gian và cỏch tiến hành của loại kit chỳng tụi lựa chọn sử dụng trong nghiờn cứu ngắn và dẽ dàng hơn so với cỏc loại kit khỏc [97].
Tiến hành lựa chọn DNA tổng số sau tỏch chiết từ những mẫu đó xỏc định HPV DNA dương tớnh (được phỏt hiện bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GP5+/GP6+ original và GP5+/GP6+ modified) để xỏc định genotype HPV bằng GeneSquare assay Kit. Quy trỡnh tiến hành theo đỳng hướng dẫn của hóng sản xuất kit. Kết quả xỏc định genotype HPV bằng GeneSquare assay Kit trờn mỏy scan cho hỡnh ảnh huỳnh quang rừ ràng, sắc nột và khụng cú hiện tượng lai chộo giữa cỏc giếng (Hỡnh 3.3. và 3.4.). Kết quả này phản ảnh quy trỡnh tiến hành xỏc định genotype HPV đó đạt chất lượng tốt.
Trong tổng số 246 mẫu HPV DNA dương tớnh khi phỏt hiện bằng phản ứng PCR cú sử dụng cặp mồi GP5+/GP6+ original và 245 mẫu HPV DNA dương tớnh khi phỏt hiện bằng phản ứng PCR cú sử dụng cặp mồi GP5+/GP6+ modified, chỳng tụi đó xỏc định được genotype HPV của 229 mẫu (93,1%) và 17 mẫu khụng xỏc định được genotype HPV. Những mẫu khụng xỏc định được genotype HPV bằng GeneSquare assay Kit được tiếp tục xỏc định genotype bằng phương phỏp giải trỡnh tự gen sau tỏch dũng.
Theo kết quả nghiờn cứu của nhúm tỏc giả Albrecht, khả năng xỏc định genotype HPV trờn 57 mẫu mụ UTCTC đó xỏc định HPV DNA dương tớnh với mồi GPMY09/GPMY11 bằng phương phỏp DNA microarray (Corningđ
UltraGAPSTM Coated Slides Kit) là 93.0%. Như vậy, khi so sỏnh khả năng xỏc định genotype HPV bằng phương phỏp DNA microarray từ những mẫu HPV DNA dương tớnh với mồi GP5+/GP6+ original và mồi GP5+/GP6+ modified của GeneSquare assay Kit sử dụng trong nghiờn cứu của chỳng tụi tương đồng với kết quả nghiờn cứu của nhúm tỏc giả trờn.