genotype HPV
2.3.2.3.1. Quy trỡnh kỹ thuật phỏt hiện HPV
* Tỏch chiết DNA tổng số từ bệnh phẩm cổ tử cung
Quy trỡnh được thực hiện trong buồng hỳt vụ trựng, trỏnh tạp nhiễm.
• Ủ dung dịch Protein Dissolvent (solution II) ở 50-60oC đến khi tan hết tủa. • Cho 100 àl dịch bệnh phẩm cổ tử cung vào ống Eppendorf 1,5 ml, sau
đú bổ xung 495 àl Protein Dissolvent (solution II) và 5 àl precipitator I. Trộn đều.
• Ủ ở 50oC trong 30 phỳt. Lắc nhẹ trong thời gian ủ. • Giảm dần về nhiệt độ phũng.
• Cho 500 àl dung dịch 2-propanol, trộn đều. • Cắm trờn đỏ 15 phỳt.
• Ly tõm 12,000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt ở 4oC. • Hỳt hết dịch nổi.
• Ly tõm 12,000 vũng/ phỳt trong 3 phỳt ở 4oC. • Hỳt hết dịch nổi.
• Cho 500 àl dung dịch Ethanol 70%, trộn đều. • Ly tõm 12,000 vũng/ phỳt trong 3 phỳt ở 4oC • Hỳt hết dịch nổi.
• Làm khụ trong buồng hỳt chõn khụng trong 5-10 phỳt/ • Cho 30 àl of nước tinh khiết vụ trựng, để trong 2 phỳt. • Dựng ngay hoặc bảo quản ở -30oC.
* Kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA bằng phương phỏp đo quang phổ
+ Phương phỏp đo quang phổ kế cho phộp xỏc định một cỏch tương đối nồng độ DNA cú trong mẫu nghiờn cứu, đồng thời kiểm tra được độ tinh sạch của mẫu đó tỏch chiết.
+ Nguyờn tắc: Phương phỏp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ỏnh sỏng tử ngoại ở bước súng 260 nm của cỏc bazơ purin và pyrimidin. Từ giỏ trị mật độ quang học (OD - Optical Density) ở bước súng 260 nm của mẫu đo cho phộp xỏc định nồng độ axit nucleic trong mẫu.
+ Một đơn vị OD tương ứng với nồng độ là 50 àg/ml cho dung dịch DNA sợi đụi hoặc 40 àg/ml cho dung dịch RNA hay DNA sợi đơn theo cụng thức tớnh như sau trong đú C là nồng độ và d là độ pha loóng mẫu:
- Với dung dịch DNA sợi đụi: CDNA = OD260 x 50 x d - Với dung dịch RNA hay DNA sợi đơn: CDNA/RNA = OD260 x 40 x d Cỏch tớnh trờn chỉ chớnh xỏc khi dung dịch axit nucleic sau tỏch chiết được tinh sạch vỡ giỏ trị thật của nồng độ axit nucleic cú thể bị sai lệch bởi cỏc protein (cấu trỳc từ acid amin thơm hoặc dị vũng: tyrosin, tryptophan, 1 số phenylalanin) trong sản phẩm tỏch chiết khụng tinh sạch cũng cú khả năng hấp thụ ở bước súng 260 nm. Tuy nhiờn, cỏc protein này lại hấp thụ cao nhất ở bước súng 280 nm, do đú ta đo thờm ở bước súng 280 nm để kiểm tra độ sạch của dung dịch.
Để đỏnh giỏ mức độ sạch của dung dịch tỏch, người ta tớnh tỉ số OD260/OD280 = T.
Nếu 1,7 < T < 2,0 thỡ dung dịch axit nucleic đú được coi là tinh sạch. + Cỏch tiến hành đo mật độ quang của DNA trong sản phẩm tỏch chiết bằng mỏy NanoDrop (Hitachi, Nhật Bản):
• Nhỏ 1àl nước cất tinh khiết vụ trựng (đó sử dụng trong quỏ trỡnh pha loóng DNA khi tỏch chiết) vào buồng đọc để xỏc định kết quả ống trắng. • Trộn đều nhẹ nhàng sản phẩm tỏch chiết, ly tõm nhẹ. Nhỏ 1àl sản phẩm
vào buồng đọc.
• Mỏy tự động đỏnh giỏ nồng độ DNA và độ tinh sạch của sản phẩm trờn đồ thị.
* Phản ứng PCR khuếch đại 140 bp vựng gen L1 HPV sử dụng mồi GP5+/GP6+ original và GP5+/GP6+ modified
+ Sử dụng mồi GP5+/GP6+ original cho phản ứng PCR: Thành phần phản ứng: Thành phần Thể tớch (àl) H2O 26,25 10x Buffer 5 2mM dNTP 5 25mM MgCl2 7 20mM GP5+ 0,625 20mM GP6+ 0,625
Ampli Taq Gold 0,5
Sản phẩm DNA tỏch chiết 5 Tổng thể tớch 50 àl Chu trỡnh nhiệt: 94oC 10 phỳt 94oC 45 giõy 48oC 4 giõy 38oC 30 giõy 42oC 5 giõy 66oC 5 giõy 71oC 90 giõy 72oC 10 phỳt 4oC vụ cựng 45 chu kỳ
+ Sử dụng mồi GP5+/GP6+ modified cho phản ứng PCR: Thành phần: Thành phần Thể tớch (àl) H2O 24,5 10x Buffer 5 2mM dNTP 5 25mM MgCl2 7 20mM GP5+ M1-2 0,5 20mM GP5+ M2-2 0,5 20mM GP5+ M3-2 0,5 20mM GP6+ M1-2 0,5 20mM GP6+ M2-2 0,5 20mM GP6+ M3 0,5
Ampli Taq Gold 0,5
Sản phẩm DNA tỏch chiết 5 Tổng thể tớch 50 àl Chu trỡnh nhiệt: 95oC 10 phỳt 95oC 30 giõy 45oC 30 giõy 74oC 30 giõy 74oC 10 phỳt 4oC vụ cựng
+ Kiểm tra HPV DNA trong sản phẩm phản ứng PCR bằng điện di trờn gel agarose:
- Chuẩn bị gel agarose 2%: cho 2g agarose vào 100 ml dung dịch đệm TBE 0,5X. Đun trong lũ vi súng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di đó cài sẵn lược. Sau khoảng 1h, khi gel đó đụng, gỡ lược và đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm TBE 0,5X vào bể để dung dịch ngập cỏch mặt gel từ 1-2 mm.
-Tra mẫu DNA: Lấy 10 àl sản phẩm PCR pha trong 2 àl đệm tra mẫu 5X và tra vào cỏc giếng nhỏ trong gel. Tra 6 àl DNA marker thang 100 bp vào 1 giếng trờn gel để làm chỉ thị phõn tử.
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, trong khoảng 30-40 phỳt. DNA di chuyển từ cực õm đến cực dương. Quan sỏt sự di chuyển của màu BromophenolBlue để biết khi nào cần dừng điện di.
- Nhuộm DNA bằng EtBr: Nhẹ nhàng lấy bản gel ra khỏi khuụn và ngõm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 àg/ml trong thời gian khoảng 10 phỳt trờn mỏy lắc nhẹ. Sau đú lấy bản gel ra trỏng nước rồi quan sỏt và chụp ảnh dưới ỏnh sỏng tia tử ngoại.