Sản phẩm PCR đa mồi có thể phân tích bằng điện di gel agarose hoặc điện di mao quản. Trong ứng dụng để phân tích di truyền liên kết, thường sử dụng điện di mao quản vì với phương pháp này có độ phân giải cao hơn (1 bp) so với điện di gel agarose (khoảng 5 bp).
Hình 11. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản
Nguyên lý của phương pháp là dùng máy điện di có 2 cực: 1 cực âm và 1 cực dương. Sợi DNA mang điện tích âm khi điện di chạy về cực dương, các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ phân tách thành các băng vạch khác nhau. Các cặp mồi để PCR phân tích bằng điện di mao quản được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau gắn vào mồi xuôi (F) hoặc ngược (R), vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các đoạn DNA được gắn các chất phát huỳnh quang tương ứng. Các DNA này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang: các hạt huỳnh quang hấp
thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn) và được camera hay bộ cảm biến ghi lại. Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó.
Phương pháp điện di mao quản có nhiều ưu điểm giúp khắc phục những hạn chế của phương pháp điện di thông thường trong phân tích các chỉ thị STR:
- Thứ nhất: phương pháp điện di mao quản có độ phân giải đến 1 nucleotide. Do vậy, các allele của các STR chỉ cần khác nhau 1 nucleotide cũng có thể phân biệt được.
- Thứ hai: trong phân tích STR, có nhiều STR có kích thước vật lý của các allele (bp) chồng lấn lên nhau. Để phân biệt các STR này, các mồi được gắn huỳnh quang với màu sắc khác nhau ở đầu 5’ của mồi xuôi. Nhờ vậy, sẽ phân biệt được các STR có kích thước các allele chồng lấn. Bằng việc kết hợp phân biệt sản phẩm bằng sự khác nhau về kích thước và màu sắc, kỹ thuật PCR đa mồi có thể được tiến hành với hàng chục cặp mồi trong cùng 1 ống.
- Thứ ba: tín hiệu huỳnh quang được khuếch đại khi bị ánh sáng kích thích, kết hợp hệ thống khuếch đại tín hiệu giúp độ nhạy của phương pháp này rất cao. Yếu tố này giúp quá trình nhân gen ở các mẫu có nồng độ thấp, đặc biệt trên mẫu chỉ có 1 bản sao (mẫu một tế bào) không đòi hỏi số chu kỳ quá lớn, cũng như không cần tiến hành phản ứng PCR lồng (nested PCR) có nhiều nguy cơ nhiễm chéo.
Sau khi khuếch đại các chỉ thị STR tạo ra các sản phẩm huỳnh quang, việc phân biệt sản phẩm (allele) của các loci (STR) dựa vào màu sắc và kích thước của đỉnh tín hiệu huỳnh quang. Kích thước của các đỉnh tín hiệu dựa trên kết quả so sánh với kích thước của thang chuẩn. Chiều cao của các đỉnh tín hiệu thể hiện độ mạnh của tín hiệu huỳnh quang. Trường hợp dị hợp tử, 1 locus (STR) sẽ có 2 allele tương ứng với 2 đỉnh tín hiệu. Trường hợp đồng hợp tử, 1 locus (STR) sẽ có 1 allele, tương ứng với 1 đỉnh tín hiệu trên hình ảnh phân tích kết quả điện di.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đa hình của các STR được nghiên cứu trên 103 mẫu máu của phụ nữ mang gen bệnh tình nguyện cung cấp cho Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019 và 50 mẫu máu của phụ nữ không mang gen bệnh thu thập từ các nghiên cứu khác thực hiện tại Phòng Phân tích DNA, Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y.
- Thiết lập và tối ưu hóa quy trình phân tích đa STR được thực hiện trên một tế bào từ 05 mẫu phôi dư do Viện mô phôi lâm sàng quân đội, Học viện Quân Y cung cấp.
- Quy trình PGT Hemophilia A được ứng dụng cho 01 cặp vợ chồng mang gen bệnh hemophilia A tình nguyện, thỏa mãn các tiêu chí sau:
+ Cơ quan sinh sản bình thường.
+ Chức năng sinh sản bình thường, thông qua xét nghiệm đánh giá chất lượng tinh trùng, xét nghiệm chức năng buồng trứng.
Các đối tượng sau sẽ bị loại trừ khỏi nhóm theo dõi để đánh giá hiệu quả của phương pháp sàng lọc:
+ Có hai buồng trứng hoặc tử cung bất thường.
+ Không thực hiện theo các hướng dẫn của bác sĩ và nghiên cứu. + Bệnh nhân bị lạc nội mạc tử cung;
+ Không đủ hồ sơ nghiên cứu hỗ trợ sinh sản.
Mẫu phôi cung cấp cho quy trình PGT được sinh thiết tại Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình gen
Công thức tính cỡ mẫu xác định tỷ lệ dị hợp tử được lấy theo phần mềm Sample Size của Tổ chức Y tế thế giới WHO như sau:
Trong đó:
+ n: cỡ mẫu cần thiết
+ α là độ tin cậy của nghiên cứu
+ Z là giá trị biểu thị độ tin cậy thu được từ bảng Z tương ứng với α + p: tỷ lệ theo mục tiêu các mẫu đạt tiêu chuẩn nghiên cứu
+ Δ: tỷ lệ sai lệch giữa quần thể mẫu nghiên cứu và quẩn thể thực. Để có ý nghĩa thống kê, tỷ lệ này chỉ giới hạn từ 0,01% tới 10%
Trong nghiên cứu này, tôi lựa chọn các thông số như sau:
+ Độ tin cậy của nghiên cứu là 95%, tương ứng với α = 0,05 và Z(1-α/2) = 1,96 + Tỷ lệ mẫu không có thông tin cho chỉ thị STR bất kỳ (đồng hợp tử) thấp nhất là 45%, tương ứng với p = 0,45
+ Tỷ lệ sai lệch so với quần thể thực là 10% tương ứng Δ = 0,1 Áp dụng vào công thức, cỡ mẫu tối thiểu thu được là 95 mẫu.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 153 mẫu máu từ các nguồn cung cấp đối tượng nghiên cứu nêu trên.
2.2.3. Sơ đồ nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo 2 giai đoạn: giai đoạn đầu nhằm xác định tính đa hình của các STR trong bộ chỉ thị thiết kế được. Giai đoạn thứ 2 nhằm tối ưu hóa các bước thực hiện để xây dựng quy trình PGT hemophilia A áp dụng quy trình xây dựng được cho gia đình bệnh nhân.
Lựa chọn các STR phục vụ chuẩn đoán Tối ưu phản ứng nhân bản STR trên thực nghiệm Xác định PIC, Ho, He của các chỉ thị STR Lựa chọn được bộ STR cho chẩn đoán hemophilia A Xây dựng quy trình phân tích STR trên phôi bào Thực hiện PGT trên gia đình mang gen
Chuyển phôi và theo dõi mang thai
Chẩn đoán trước sinh kiểm tra kết quả
Xây dựng và áp dụng quy trình PGT hemophilia A Xác định tính đa hình của các STR liên kết gen F8
2.3. Hóa chất và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
*Hóa chất dùng để tách chiết DNA: QIAGEN blood Minikit; cồn tuyệt đối dùng trong thí nghiệm sinh học phân tử Merk
*Hóa chất dùng để khuếch đại toàn hệ gen tế bào: REPLI-g Single Cell Kit QIAGEN
*Hóa chất để thực hiện kỹ thuật PCR: QIAGEN Multiplex PCR 2X Mastermix; QIAGEN Q-Solution; Các cặp mồi (IDT)
*Hóa chất để điện di agarose sản phẩm PCR: Bột Agarose LE (Roche); TBE Buffer 10X (Serva); Agarose gel loading dye 6x (Intron); 100bp Ladder (Norgen); RedSafe Nucleic Acid staining solution (Intron)
*Hóa chất để điện di mao quản sản phẩm PCR: CE Running buffer 10X (MCLAB),
Nano POP4 dùng cho máy ABI3130/3130XL (MCLAB), Size standard Genscan 500LIZ (Thermo Fisher Scientific), Hi-Di Formamide (Thermo Fisher Scientific)
*Dụng cụ: Ống Eppendorf 1,5 ml - 0,5 ml - 0,2 ml; Ống lấy máu chống đông EDTA; Găng tay vô khuẩn; Khẩu trang y tế; Hộp giữ mẫu; Pipet, đầu tips các loại dùng cho kỹ thuật sinh học phân tử
*Thiết bị: Máy Proflex PCR System (Thermo Fisher Scientific); Máy đo NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific); Máy đo Qubit 3.0 Fluorometric Quantitation (Life Technologies); Bộ điện di NANOPAC 300P (Cleaver); Tủ lạnh sâu: -20oC, -80oC (Panasonic); Máy ly tâm lạnh Hitech và ly tâm để bàn Boeco; Máy giải trình tự gen ABI Prism 3130XL Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific); Tủ an toàn sinh học cấp II dùng trong sinh học phân tử; Máy ủ nhiệt và lắc MTH – 100 (Holdwell); Máy lắc MS3 basic (IKA); Cân điện tử Practum (Sartorius)
2.4. Các kỹ thuật được sử dụng
2.4.1. Giai đoạn tối ưu và xác định tính đa hình
2.4.1.1. Kỹ thuật sàng lọc chỉ thị STR
Sử dụng cơ sở dữ liệu STR và phần mềm Tandem Repeat Finder (TRF) cung cấp bởi Gary Benson và cộng sự (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html) để tiến hành sàng lọc chỉ thị xác định đột biến gen F8 theo tiêu chuẩn hướng dẫn bởi Machado năm
2009 [47], sử dụng trình tự tham chiếu cho NST X của người trên NCBI với mã truy cập NC_000023: cài đặt thông số align bao gồm Match: 2, Mismatch: 2, Indels: 7; vị trí tìm kiếm cách 1Mbp về phía trước, sau gen F8 và trong gen; tiêu chí chọn lọc: số lần lặp trình tự từ 2 đến 6 với điểm Align thấp nhất với trình tự trên NST X tương ứng là 54, 80, 66, 52 (là điểm thấp nhất của các chỉ thị nội gen F8 có số lần lặp như vậy và được đánh giá là có giá trị đa hình di truyền thông qua xác định kiểu gen trực tiếp), % Match ≥ 80.
Hình 13. Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để sàng lọc
Để lựa chọn hệ thống chỉ thị STR có thể sử dụng trên quần thể người Việt Nam: từ những STR đã sàng lọc được từ phần mềm TRF, dựa trên dữ liệu được báo cáo từ các nghiên cứu đã tiến hành trên quần thể người Brazil [47, 50], New Zealand [42], Trung Quốc [17, 72], tiếp tục chọn ra các chỉ thị STR có các chỉ số PIC, H(exp), H(ob) > 0,5 và có mồi khuếch đại đáp ứng yêu cầu khuyến cáo của QIAGEN bao gồm: kích thước 20 – 30 nucleotide, nhiệt độ Tm ≥ 60oC, có không quá 3 nucleotide G hoặc C ở đầu 3’ và 2 mồi không bắt cặp nhau ở đầu 3’. Tiếp tục chọn lọc theo kích thước sản phẩm khuếch đại sao cho các sản phẩm cách nhau khoảng 10 nucleotide, từ đó xác định kích thước sản phẩm nhỏ nhất và chia làm các nhóm với khoảng cách sản
phẩm khuếch đại là 10 nucleotide. Cuối cùng chọn chỉ thị đại diện sao cho tổng thể có cả chỉ thị trước, trong và sau gen F8.
Sau khi lựa chọn được các STR và mồi khuếch đại đáp ứng tiêu chí sàng lọc, sử dụng công cụ In-silico PCR tại https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr với hệ gen tham chiếu là GRCh38/hg38 kết hợp phần mềm so sánh trình tự BLAST trên NCBI nhằm xác định sơ bộ các allel của loci để loại bỏ các chỉ thị có trình tự mồi bắt cặp với các đoạn lặp Alu và các trình tự không đặc hiệu trên NST khác, sau đó gắn huỳnh quang cho một mồi trong mỗi cặp sao cho các sản phẩm của các mồi cùng màu huỳnh quang có thể phân biệt được với nhau.
2.4.1.2. Kỹ thuật tách DNA
Sử dụng QIAGEN blood Minikit theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể như sau:
Chuẩn bị hóa chất trước thí nghiệm: Tất cả hóa chất phải đưa về 15-25oC trước khi sử dụng. Lắc kỹ các lọ hóa chất trước khi tiến hành quy trình.Đặt nhiệt độ của block máy ủ nhiệt ở 70oC trước khi tiến hành thí nghiệm. AW1, AW2 được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Thực hiện quy trình: Cho 20 µl proteinase vào ống Eppendorf 1,5 ml. Tiếp theo cho 200 µl mẫu (máu, dịch ối) và 200 µl AL vào ống, đóng nắp, vortex 15 giây.Ủ lắc ở 60oC trong 15 phút. Thêm tiếp 200 µl cồn tuyệt đối vào ống, đóng nắp, vortex 15 giây. Sau đó chuyển toàn bộ hỗ dịch ở bước 4 vào cột lọc QIAamp, không làm ướt mép ống, đóng nắp, ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút; đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa dịch lọc đi.Mở nắp cột lọc, thêm 500 µl AW1, không làm ướt mép cột, đóng nắp, ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút, đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa dịch lọc đi. Mở nắp cột lọc, thêm 500 µl AW2, không làm ướt mép cột, đóng nắp, ly tâm ở 18000 vòng/phút trong 2 phút, đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa dịch lọc đi.Ly tâm ở 18000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ ống 2 ml. Đặt cột lọc vào ống Eppendorf 1,5 ml sạch, thêm 50 µl AE buffer vào trung tâm của màng lọc, không chạm vào màng lọc; ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Cuối cùng ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA hòa tan từ màng lọc.Bảo quản ở 2-8oC và thực hiện phản ứng trong cùng ngày tách.
2.4.1.3. Kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen
Sử dụng REPLI-g Single Cell Kit QIAGEN (USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể như sau: rã đông REPLI-g sc DNA Polymerase trên đá, các hóa chất còn lại rã đông ở nhiệt độ phòng, trong đó buffer D2 pha sẵn phải được sử dụng trong vòng 3 tháng. Bổ sung 500µl H2O vào ống Buffer DLB trước khi sử dụng (sau khi pha loãng phải sử dụng trong vòng 6 tháng và lưu trữ ở -20oC). Nếu sử dụng máy luân nhiệt (PCR) thay cho bể ổn nhiệt, cài đặt nhiệt độ làm nóng nắp block ở 70OC. Sau đó thực hiện quy trình bao gồm các bước: cho 4 µl dung dịch PBS chứa tế bào vào ống PCR. Nếu thể tích mẫu ban đầu ít hơn 4µl, bổ sung thêm PBS để thu được tổng dung dịch chứa tế bào là 4 µl. Chuẩn bị Buffer D2 (Denaturation buffer) theo bảng 4. Thêm 3 µl Buffer D2 vào mỗi ống. Búng nhẹ để trộn và ly tâm ngắn để thu dung dịch về đáy ống. Ủ ở 65oC trong 10 phút. Sau đó thêm 3 µl Stop Solution vào mỗi ống rồi búng nhẹ để trộn và ly tâm ngắn để thu dung dịch về đáy ống. Đặt trên đá lạnh/khay lạnh. Rã đông REPLI- g sc DNA Polymerase trên đá và các hóa chất khác ở nhiệt độ phòng và chuẩn bị Mastermix theo bảng 5 (đã lấy dư). Thêm 40 µl mastermix vào mỗi ống. Cài đặt chu trình nhiệt bao gồm: 30OC trong 8 giờ, 65OC trong 3 phút và lưu trữ ở 4OC. Cài đặt nắp block nhiệt ở 70oC, lưu trữ và bảo quản mẫu ở -20OC.
Bảng 4. Thành phần D2 Số ống phản ứng DTT, 1M (µl) Buffer DLB (µl) 1 0,25 2,75 12 3 33 24 6 66 25 6,25 68,75 26 6,5 71,5
Bảng 5. Thành phần Mastermix Số ống phản ứng H2O (µl) REPLI-g sc React. Buffer (µl) REPLIC-g sc DNA Polymerase (µl) 1 9 29 2 2 19,8 63,8 4,4 3 29,7 95,7 6,6 4 39,6 127,6 8,8 5 49,5 159,5 11 6 59,4 191,4 13,2 7 69,3 223,3 15,4 8 79,2 255,2 17,6 9 89,1 287,1 19,8 10 99 319 22 11 108,9 350,9 24,2 12 118,8 382,8 26,4 13 122,85 395,85 27,3 14 132,3 426,3 29,4 15 141,75 456,75 31,5 16 151,2 487,2 33,6
Kiểm tra nồng độ DNA sau WGA:
Nồng độ của sản phẩm khuếch đại hệ gen được tính bằng cách đo nồng độ của mẫu sản phẩm pha loãng sau đó nhân hệ số để có nồng độ gốc. Các sản phẩm bước WGA được pha loãng tỷ lệ 1:10 trước khi tiến hành đo. Chuẩn bị dung dịch Qubit working solution theo tỷ lệ: 1 µl reagent (dye): 100 µl Buffer. Bổ sung 190 µl dung dịch Qubit working solution vào các ống 0,5ml mới đã chuẩn bị trước đó. Tiếp tục thêm 10 µl chất chuẩn 1 và 2 vào hai ống 0,5 ml đã chứa 190 µl dung dịch Qubit working solution. Các ống còn lại được bổ sung thêm 10 µl các mẫu đã pha loãng
tương ứng. Trộn đều các ống bằng vortex và ly tâm nhanh. Chuẩn máy đo Qubit sử dụng 2 ống chất chuẩn vừa chuẩn bị và đo các mẫu rồi ghi lại nồng độ các mẫu.
2.4.1.4. Kỹ thuật PCR đa mồi
Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi: sau khi sử dụng công cụ http://sg.idtdna.com/calc/analyzer xác định được nhiệt độ nóng chảy Tm từ đó tính toán nhiệt độ gắn mồi trung bình của tất cả các cặp mồi, tiến hành phản ứng PCR cho riêng mỗi cặp mồi theo gradient nhiệt độ gắn mồi trung bình với khoảng cách 5oC. Dựa trên kết quả điện di trên gel agarose 2% (120V trong 30 phút) tiếp tục tối ưu bằng gradient nhiệt độ với bước nhảy 1oC.