3.2.1. Áp dụng quy trình PGT-M trên gia đình bệnh nhân
Gia đình bệnh nhân tình nguyện tham gia nghiên cứu có con trai (kí hiệu mẫu He180916 02-P) được chẩn đoán hemophilia A từ 9 tháng tuổi tại bệnh viên Nhi TW, đến tháng 5/2010 chuyển đến Viện Huyết học – Truyền máu TW khám và làm hồ sơ quản lý. Kết quả xét nghiệm sinh học phân tử tại Viện Huyết học – Truyền máu TW cho thấy người mẹ (kí hiệu mẫu He180916 02-M) mang đảo đoạn intron 22 trên gen F8. Người cha (kí hiệu mẫu He180916 02-F) không mang đột biến gen F8.
Cặp vợ chồng nói trên thực hiện IVF tại bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội được 04 phôi. Các phôi bào được sinh thiết từ 04 phôi này (kí hiệu từ He180916 02-Q1 tới He180916 02-Q4), thực hiện WGA và phân tích đột biến gen F8 bằng bộ chỉ thị STR vừa thiết lập, thu được kết quả PGT thể hiện từ hình 30 đến hình 33.
Hình 30. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q1
Hình 31. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q2
Hình 32.Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q3
Hình 33. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q4
Phôi bào He180916 02-Q1 không xuất hiện allele có đỉnh kích thước 145 bp của chỉ thị Amelogenin trên NST Y (Hình 30), như vậy phôi này nhận các STR trên một NST X từ bố và một NST X từ mẹ. Ngoài các allele STR nhận từ bố có kích thước giống với bố (kí hiệu mẫu He180916 02-F), allele STR còn lại giống với bộ allele STR của người con trai bị bệnh (nhận một NST X mang allele F8 gây bệnh từ mẹ). Như vậy, phôi bào He180916 02-Q1 mang allele F8 gây bệnh Hemophilia A và không nên cấy phôi vào tử cung.
Các phôi bào He180916 02-Q2, He180916 02-Q3 không xuất hiện allele có đỉnh kích thước 145 bp của chỉ thị Amelogenin trên NST Y (Hình 31-32), như vậy phôi này nhận các STR trên một NST X từ bố và một NST X từ mẹ. Ngoài các allele STR nhận từ bố có kích thước giống với bố (He180916 02-F), bộ allele STR còn lại không giống với bộ allele STR của người con trai bị bệnh (He180916 02-P) mà giống với bộ STR không liên kết với allele F8 gây bệnh của mẹ (He180916 02-M). Như vậy, các phôi bào He180916 02-E2 và He180916 02-E3 không mang allele F8 gây bệnh Hemophilia A và có thể tiến hành chuyển phôi.
Phôi bào He180916 02-Q4 xuất hiện allele có đỉnh kích thước 145 bp của chỉ thị Amelogenin trên NST Y, như vậy phôi này nhận các STR trên một NST X từ mẹ và một NST Y từ bố. Các allele STR nhận từ mẹ có kích thước không giống với mẫu He180916 02-P của người con trai bị bệnh. Như vậy, có thể kết luận phôi bào He180916 02-Q4 không mang allele F8 gây bệnh Hemophilia A và cũng có thể tiến hành chuyển phôi.
Như vậy, trong số 04 phôi của gia đình bệnh nhân được áp dụng PGT-M, có 01 phôi mang allele F8 gây bệnh là He180916 02-Q1 (không nên cấy vào tử cung) và 03 phôi không mang allele F8 gây bệnh, có thể cấy vào tử cung là He180916 02- Q2, He180916 02-Q3 và He180916 02-Q4.
Hình 34. Kết quả phân tích di truyền liên kết phục vụ PGT-M hemophilia A của gia đình bệnh nhân tham gia nghiên cứu
Bảng 19. Kết quả phân tích đột biến gen F8 ở phôi IVF
Kí hiệu gia
đình Tổng số phôi Phôi không có allele F8 đột
biến Phôi có allele F8 đột biến Phôi WGA thất bại He180916 02 04 03 01 0
3.2.2. Kết quả mang thai và chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân
Sau khi tiến hành chuyển phôi cho gia đình bệnh nhân, thai phụ được theo dõi và lấy mẫu ối (He180916 02-O) để chẩn đoán trước sinh khi thai nhi đạt 16 tuần tuổi. Kết quả phân tích di truyền liên kết cho mẫu dịch ối sử dụng bộ chỉ thị STR thiết kế được cho thấy thai nhi không mang allele F8 gây bệnh hemophilia A.
Kết quả đối chiếu bằng phương pháp Longrange-PCR thực hiện tại Viện Huyết học - Truyền máu TW cũng cho thấy không phát hiện đảo đoạn intron 22 ở mẫu dịch ối, đồng thời khẳng định thai nhi không mang allele F8 gây bệnh hemophilia A.
Hình 35. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng Longrange PCR do Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương thực hiện
Hình 37. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng phân tích di truyền liên kết sử dụng bộ STR thiết kế được
Như vậy, kết quả phân tích gián tiếp đột biến gen F8 thông qua các STR đa hình liên kết chặt với gen F8 trước chuyển phôi và trước sinh phù hợp với kết quả phân tích trực tiếp đột biến gen F8 bằng Longrange-PCR (Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương). Nghiên cứu của chúng tôi đã đạt được mục tiêu xây dựng bộ chỉ thị STR đảm bảo tính đa hình cao, liên kết chặt với gen F8, phục vụ chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi hemophilia A và áp dụng thành công cho gia đình bệnh nhân.
So với nghiên cứu trước đây ở Việt Nam cũng sử dụng phương pháp phân tích di truyền liên kết với chỉ thị STR để phục vụ PGT-M hemophilia A nhưng khuếch đại chỉ thị bằng PCR đơn mồi [2], nghiên cứu của chúng tôi có thời gian chẩn đoán nhanh và tiết kiệm kinh phí cũng như công lao động hơn trong khi vẫn đảm bảo tính chính xác nhờ kỹ thuật PCR đa mồi khuếch đại bộ chỉ thị trong cùng một phản ứng. Khi được áp dụng rộng rãi tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản, quy trình PGT trong nghiên cứu này sẽ góp phần giảm gánh nặng kinh tế cũng như tâm lý cho các gia đình có allele F8 gây bệnh. Các em bé được sinh ra sẽ không cần tiến hành sàng lọc gen bệnh hay tư vấn tiền hôn nhân khi đến tuổi trưởng thành.
Bên cạnh những ưu điểm trên, trong nghiên cứu vẫn có hiện tượng ADO ở một số chỉ thị STR trên các mẫu phôi được tiến hành chẩn đoán. Hình ảnh đỉnh kích thước sản phẩm điện di mao quản của mẫu phôi với tín hiệu không cao, hình dạng không điển hình cho thấy cần phải kiểm soát tốt hơn quy trình sinh thiết cũng như vận chuyển mẫu để đảm bảo chất lượng tế bào phôi. Trong giai đoạn áp dụng quy trình PGT cho các gia đình bệnh nhân, khi số lượng phôi được chẩn đoán đủ lớn, cần tiến hành thống kê để loại bỏ các chỉ thị có tỷ lệ ADO quá cao, tiếp tục tối ưu bộ chỉ thị để đảm bảo hiệu quả chẩn đoán.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã thiết lập thành công bộ chỉ thị gồm 13 STR đa hình cao và di truyền liên kết chặt chẽ với gen F8, phục vụ chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi.
2. Đã áp dụng thành công quy trình chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi từ bộ chỉ thị xây dựng được cho 01 gia đình bệnh nhân.
Kiến nghị
1. Mở rộng quy mô nghiên cứu chỉ số đa hình của các chỉ thị STR trong bộ thiết kế được trên các dân tộc khác nhau ở Việt Nam.
2. Áp dụng quy trình PGT-M hemophilia A xây dựng được tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt:
1. Lưu Vũ Dũng (2014), Nghiên cứu xác định đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A, Đại học Y Hà Nội.
2. Trần Vân Khánh, Phạm Lê Anh Tuấn, Nguyễn Quý Hoài, Nguyễn Thị Minh, Nguyễn Viết Tiến (2016), "Chẩn đoán tiền làm tổ bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật Microsattlite DNA", Tạp chí nghiên cứu Y Học, pp. 7.
3. Lê Nhật Minh, Võ Thị Thương Lan và Đỗ Trung Phấn (2004), "Sử dụng phương pháp ADN (PCR-RFLP) vùng intron 18 để xác định các cá thể mang gen bệnh máu khó đông Hemophilia A", Tạp chí Y học thực hành. 8, pp. 61 - 62.
4. Vũ Văn Quỳ (2010), Nghiên cứu tần suất alen của một số locus gen ở người Việt, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
5. Bạch Quốc Tuyên (1991), Nhân một trường hợp Hemophilia A có kháng thể kháng VIII- Bàn về kháng đông lưu hành, Bài giảng huyết học.
Tài liệu tiếng Anh:
6. Bagnall R., F. Giannelli and P. Green (2005), "Polymorphism and hemophilia A causing inversions in distal Xq28: a complex picture", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3(11), pp. 2598-2599.
7. Bagnall R. D., N. Waseem, P. M. Green and F. Giannelli (2002), "Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause of severe hemophilia A", Blood. 99(1), pp. 168-174.
8. Bogdanova N., A. Markoff, H. Pollmann, U. Nowak‐Göttl, R. Eisert, B. Dworniczak, A. Eigel and J. Horst (2002), "Prevalence of small rearrangements in the factor VIII gene F8C among patients with severe hemophilia A", Human mutation. 20(3), pp. 236-237.
9. Bogdanova N., A. Markoff, H. Pollmann, U. Nowak‐Göttl, R. Eisert, C. Wermes, A. Todorova, A. Eigel, B. Dworniczak and J. Horst (2005), "Spectrum of molecular defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A", Human mutation. 26(3), pp. 249-254.
10. Butler J. M. (2006), "Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing", Journal of forensic sciences. 51(2), pp. 253-265.
11. Butler J. M. (2007), "Short tandem repeat typing technologies used in human identity testing", Biotechniques. 43(4), pp. Sii-Sv.
12. Castaldo G., V. D'Argenio, P. Nardiello, F. Zarrilli, V. Sanna, A. Rocino, A. Coppola, G. Di Minno and F. Salvatore (2007), "Haemophilia A: molecular insights",
Clinical Chemical Laboratory Medicine. 45(4), pp. 450-461.
13. Chamberlain J. S., R. A. Gibbs, J. E. Rainer, P. N. Nguyen and C. Thomas (1988), "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification", Nucleic acids research. 16(23), pp. 11141-11156.
14. Cooke H. (1976), "Repeated sequence specific to human males", Nature. 262, pp. 182-186.
15. Cora N. I. R., F. I. Delgado, S. M. M. Ramírez and J. V. Quiñones (2017), "Acquired Hemophilia A in an advanced age patient of hispanic origin: a case report",
BMC research notes. 10(1), pp. 438.
16. Cumming A. (2004), "The factor VIII gene intron 1 inversion mutation: prevalence in severe hemophilia A patients in the UK", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2(1), pp. 205-206.
17. Ding Q., Y. Lu, J. Dai, X. Xi, X. Wang and H. Wang (2012), "Characterisation and validation of a novel panel of the six short tandem repeats for genetic counselling in Chinese haemophilia A pedigrees", Haemophilia. 18(4), pp. 621-625.
18. Eaton D., H. Rodriguez and G. A. Vehar (1986), "Proteolytic processing of human factor VIII. Correlation of specific cleavages by thrombin, factor Xa, and activated protein C with activation and inactivation of factor VIII coagulant activity",
Biochemistry. 25(2), pp. 505-512.
19. EL‐MAARRI O., U. Herbiniaux, J. Graw, J. Schröder, A. Terzic, M. Watzka, H. Brackmann, W. Schramm, P. Hanfland and R. Schwaab (2005), "Analysis of mRNA in hemophilia A patients with undetectable mutations reveals normal splicing in the factor VIII gene", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3(2), pp. 332-339.
20. Fisch E., E. Fricke, S. Baedker, U. Deutsch, R. Ahmed, D. Loeffert and C. Korfhage (2014), "Accurate Genome Analysis of Single Cells", Journal of Biomolecular Techniques : JBT.
21. Forman E. J., K. H. Hong, K. M. Ferry, X. Tao, D. Taylor, B. Levy, N. R. Treff and R. T. Scott Jr (2013), "In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial", Fertility and sterility. 100(1), pp. 100-107. e1.
22. Franchini M., M. Montagnana, G. Targher, D. Veneri, M. Zaffanello, G. L. Salvagno, F. Manzato and G. Lippi (2009), Interpatient phenotypic inconsistency in severe congenital hemophilia: a systematic review of the role of inherited thrombophilia, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr. 307-312.
23. Ganguly A., T. Dunbar, P. Chen, L. Godmilow and T. Ganguly (2003), "Exon skipping caused by an intronic insertion of a young Alu Yb9 element leads to severe hemophilia A", Human genetics. 113(4), pp. 348-352.
24. Gawad C., W. Koh and S. R. Quake (2016), "Single-cell genome sequencing: current state of the science", Nature Reviews Genetics. 17(3), pp. 175.
25. Goodeve A. (2008), Molecular genetic testing of hemophilia A, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr. 491-501.
26. Goodeve A. C., I. Williams and G. L. Bray (2000), "Relationship between factor VIII mutation type and inhibitor development in a cohort of previously untreated patients treated with recombinant factor VIII (Recombinate™)", Thrombosis and haemostasis. 83(6), pp. 844-848.
27. Graw J., H.-H. Brackmann, J. Oldenburg, R. Schneppenheim, M. Spannagl and R. Schwaab (2005), "Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies",
Nature Reviews Genetics. 6(6), pp. 488-501.
28. Griffin D. K., L. J. Wilton, A. H. Handvside, R. M. Winston and J. D. Delhanty (1992), "Dual fluorescent in situ hybridisation for simultaneous detection of X and Y chromosome-specific probes for the sexing of human preimplantation embryonic nuclei", Human genetics. 89(1), pp. 18-22.
29. Griffin D. K., L. J. Wilton, A. H. Handyside, G. Atkinson, R. Winston and J. Delhanty (1993), "Diagnosis of sex in preimplantation embryos by fluorescent in situ hybridisation", BMJ: British Medical Journal. 306(6889), pp. 1382.
30. Grifo J. A., B. Hodes-Wertz, H.-L. Lee, E. Amperloquio, M. Clarke-Williams and A. Adler (2013), "Single thawed euploid embryo transfer improves IVF pregnancy, miscarriage, and multiple gestation outcomes and has similar implantation rates as egg donation", Journal of assisted reproduction and genetics. 30(2), pp. 259-264. 31. Guo X. and R. J. H. h. Elston (1999), "Linkage information content of polymorphic genetic markers". 49(2), pp. 112-118.
32. Harton G., M. De Rycke, F. Fiorentino, C. Moutou, S. SenGupta, J. Traeger- Synodinos and J. J. H. r. Harper (2010), "ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD". 26(1), pp. 33-40.
33. High K. A. (2012), "The gene therapy journey for hemophilia: are we there yet?",
ASH Education Program Book. 2012(1), pp. 375-381.
34. Hoffbrand V. and P. A. Moss (2011), Essential haematology, Vol. 28, John Wiley & Sons.
35. Huang J., J. Pang, T. Watanabe, H.-K. Ng and H. Ohgaki (2009), "Whole genome amplification for array comparative genomic hybridization using DNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded histological sections", The Journal of Molecular Diagnostics. 11(2), pp. 109-116.
36. Jayandharan G. R. and A. Srivastava (2008), The phenotypic heterogeneity of severe hemophilia, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr. 128-141.
37. Justice U. D. o. (2002), Using DNA to Solve Cold Cases, National Commission on the Future of DNA Evidence.
38. Keeney S., M. Mitchell and A. Goodeve (2010), Practice Guidelines for the Molecular Diagnosis of Haemophilia A, chủ biên, UK Haemophilia Centre Doctors’ Organisation, CMGS Website.
39. Kemball-Cook G., E. G. Tuddenham and A. I. Wacey (1998), "The factor VIII structure and mutation resource site: HAMSTeRS version 4", Nucleic acids research. 26(1), pp. 216-219.
40. Kogan S. C., M. Doherty and J. Gitschier (1987), "An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequences", New England Journal of Medicine. 317(16), pp. 985-990.
41. Lakich D., H. H. Kazazian, S. E. Antonarakis and J. Gitschier (1993), "Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A", Nature genetics. 5(3), pp. 236-241.
42. Laurie A., A. Hill, J. Harraway, A. Fellowes, G. Phillipson, P. Benny, M. Smith and P. George (2010), "Preimplantation genetic diagnosis for hemophilia A using indirect linkage analysis and direct genotyping approaches", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8(4), pp. 783-789.
43. Liu J., Q. Liu, Y. Liang, L. Wang, G. Nozary, B. Xiao, Z. Zhu, Y. Zhou, L. Liu and Y. Guan (1999), "PCR assay for the inversion causing severe Hemophilia A and its application", Chinese medical journal. 112(5), pp. 419-423.
44. Liu Q., G. Nozari and S. S. Sommer (1998), "Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in hemophilia A",
Blood. 92(4), pp. 1458-1459.