Để nâng cao tỷ lệ thành công và trẻ sinh sống khoẻ mạnh trong điều trị IVF thì việc chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Diagnosis - PGD) là một trong những yêu cầu quan trọng, cấp thiết và thực tiễn [21, 30]. Cụ thể, trong suốt chu trình IVF, một hoặc một số tế bào được sinh thiết vào ngày thứ 3 hoặc thứ 5. DNA trong tế bào phôi được phân tích kiểu gen, đồng thời phòng thí nghiệm cũng phân tích DNA trong máu của bố, mẹ và một số thành viên gia đình khác để xác định kiểu gen gây bệnh và so sánh với phôi để kiểm tra phôi có bị bệnh không. Sau khi hoàn thành các bước này, các phôi được sàng lọc để chỉ giữ lại phôi không mang bệnh. PGD được báo cáo lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1990, cho đến nay đã được sử dụng như một phương tiện chẩn đoán lâm sàng trong điều trị và áp dụng một cách rộng rãi. Hàng năm số trường hợp PGD tăng gần gấp đôi, hàng chục ngàn trẻ ra đời từ các trung tâm IVF trên thế giới sau chẩn đoán PGD và chưa có công bố nào tìm thấy ảnh hưởng xấu của PGD ở trẻ ra đời bằng phương pháp này. Hiện nay, thuật ngữ PGD được thay thế bằng PGT-M (đối với bệnh lý đơn gen); PGT-SR (đối với cấu trúc NST); PGT-A (đối với dị bội). Hiện nay ngoài kỹ thuật IVF truyền thống thì kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection - ICSI) cũng được thực hiện tạo nhiều trung tâm hỗ trợ sinh sản để tăng hiệu quả thụ tinh, vì trong IVF trứng được cấy với hàng trăm tinh trùng còn trong ICSI chỉ với một tinh trùng được lựa chọn là tốt nhất về mặt hình thái cũng như khả năng di động.
Để có thể phân tích DNA từ mẫu phôi đơn bào, trước tiên cần tiến hành khuếch đại toàn hệ gen (Whole Genome Amplification – WGA). WGA là phương pháp khuếch đại toàn bộ hệ gen từ những mẫu có lượng DNA rất ít chỉ khoảng vài pg/µl. Phương pháp này được áp dụng phổ biến trong lĩnh vực pháp y và nghiên cứu, chẩn đoán các bệnh di truyền [67, 80]. Đây cũng là bước chuẩn bị cho các kỹ thuật tiếp theo như giải trình tự thế hệ mới [20, 64] và array CGH [35]. Để tiến hành WGA, có thể sử dụng 1 trong 3 phương pháp: PCR bằng mồi thoái hóa (Degenerate Oligonucleotide Primed PCR – DOP PCR), khuếch đại thay thế đa điểm (Multiple
Displacement Amplification – MDA), và phương pháp lai (Hybrid methods). Việc lựa chọn kỹ thuật tùy thuộc vào mục đích sử dụng sản phẩm WGA, dựa trên các đặc điểm của từng kỹ thuật thể hiện trong hình 10. Trong PGD, phương pháp WGA được sử dụng là MDA vì phương pháp này khắc phục được các hạn chế của các kỹ thuật WGA dựa trên PCR khác, như việc tạo các đoạn DNA tương đối ngắn, không đủ thông tin và nguy cơ xảy ra khuếch đại sai trong sản phẩm gây dương tính hoặc âm tính giả [60].
Hình 10. Sơ đồ nguyên lý 3 kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen [24]
1.2.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A
Có nhiều cách tiếp cận chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A. Trong đó, cách tiếp cận đơn giản nhất là sàng lọc giới tính của phôi hoặc thai nhi. Một số kỹ thuật được sử dụng cho hướng tiếp cận này là kỹ thuật kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization – FISH) sử dụng đầu dò Vysis [28, 29]; kỹ thuật PCR khuếch đại các trình tự lặp lại đặc hiệu trên cánh dài nhiễm sắc thể Y [14,
40] hoặc đồng thời khuếch đại trình tự satellite alpha ở vùng tâm động của nhiễm sắc thể X và Y để kiểm soát việc kết luận nhầm giới tính do khuếch đại sai [79]. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp lựa chọn được 50% số phôi có thể sử dụng cho chuyển phôi, 25% phôi nữ mang gen những không bị bệnh bị loại bỏ không cần thiết, đặc biệt là đối với những cặp vợ chồng có số phôi hạn chế thì đây là nhược điểm rất lớn. Ngoài ra, các kỹ thuật này còn nhiều hạn chế như lai huỳnh quang đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và giá thành cao.
Cách tiếp cận khác sử dụng kỹ thuật nhận diện trực tiếp đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia khá phức tạp do trong tự nhiên có nhiều dạng dị hợp và các dạng đảo đoạn lớn. Đặc biệt, hiện tượng ADO ( allele dropout - khuếch đại hỏng 1 trong 2 allele ở tế bào thể dị hợp) ảnh hưởng tới hơn 40% các ca chẩn đoán trước chuyển phôi, dẫn tới nhiều kết quả không chính xác [66]. Khác với chẩn đoán thông thường dựa trên DNA tổng số với nhiều bản sao nên độ nhạy của các kỹ thuật không khiến kết quả bị ảnh hưởng quá nhiều nếu có một vài allele bị khuếch đại hỏng, mẫu DNA cho chẩn đoán trước chuyển phôi được cung cấp bởi chỉ 1-2 bản sao trong tế bào nên nếu có ADO, kết quả sẽ bị sai lệch hoàn toàn. Có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng tới chỉ số ADO như quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu, điều kiện PCR làm ảnh hưởng cấu trúc DNA hay lượng DNA đưa vào thí nghiệm không đủ do lỗi trong quá trình WGA hoặc tách chiết từ mẫu [62].
Ngoài nguy cơ ADO, vì đặc trưng của PCR trong PGT-M là cực nhạy nên rất dễ nhiễm DNA ngoại lai [73, 76]. Nguồn DNA ngoại lai rất phong phú nhưng chủ yếu thường xảy ra trong các giai đoạn trước bước tiến hành PCR đó là sinh thiết phôi và rửa tế bào phôi [76]; DNA ngoại nhiễm có thể từ kỹ thuật viên sinh thiết phôi hoặc DNA trong khu vực sinh thiết, rửa tế bào. Mẫu giọt rửa làm đối chứng âm xuất hiện DNA cũng có thể do quá trình sinh thiết phôi không thành công khiến tế bào bị vỡ làm thất thoát DNA vào giọt rửa.
Để khắc phục các nhược điểm của các hướng tiếp cận trên, nhiều nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật phân tích liên kết gen xác định gián tiếp đột biến qua các chỉ thị di truyền. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu chọn lọc chỉ thị là đoạn lặp
ngẫu nhiên ngắn (Short tandem repeat – STR) cho hemophilia A ở các quần thể người bệnh khác nhau như Brazil [47, 50], New Zealand [42], Trung Quốc [17, 72].
Bảng 3. Một số STR được sử dụng trong chẩn đoán Hemophilia A [47]
STT Tên Locus Trình tự lặp Tần số dị hợp tử quan sát (%) Trong gen F8 1 F8Int1 AC 34 2 F8Int6 TG 1.5 3 F8Int9 AG 28 4 F8Int13 AC 46 5 F8Int22 GT 40 6 F8Int25.3 TG 35 Ngoài gen F8 7 DXS9897 CTAT 68 8 DXS15 CA 88 9 DXS9901 CT/TG 82 10 IKBKG TG 22 11 DXS1073 TG 63 12 HA472 CTT 94 13 HA544 TTC 6 14 DXS1108 CA 35
Ở Việt Nam, vào tháng 1 năm 2016 cũng đã có nghiên cứu chẩn đoán trước chuyển phôi bệnh hemophilia A bằng STR [2]. Đây là một phần nội dung trong đề tài cấp nhà nước thuộc Chương trình KC 04/11-15 [12]. Nghiên cứu đã tiến thành kỹ thuật chẩn đoán trước chuyển phôi cho 3 gia đình mang gen bệnh hemophilia A. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng bộ 14 STR (bảng 3) phục vụ sàng lọc người mẹ mang gen và chẩn đoán trước chuyển phôi trên các phôi thụ tinh trong
ống nghiệm. Nhóm tác giả đã tiến hành sàng lọc bằng phương pháp xác định các STR dị hợp tử sử dụng kỹ thật PCR đơn mồi để tìm các chỉ thị dị hợp tử trên mẫu DNA của mẹ và trẻ bị bệnh. Do vậy, nhóm nghiên cứu phải tiến hành tối thiểu 14 phản ứng PCR mỗi mẫu nghiên cứu nhằm tìm được chỉ thị dị hợp tử trên mẫu máu mẹ; sau đó tiếp tục tiến hành những phản ứng PCR đơn mồi tiếp theo để xác định các STR dị hợp tự của mẹ trên con. Trong báo cáo, không thấy nhóm nghiên cứu xác định các allele của các STR trên mẫu của bố, nhằm kiểu soát nhiễm, và tránh sự trùng lặp giữa các STR dị hợp tử của mẹ này có allele trùng với của mẫu bố.
Tuy sử dụng kỹ thuật phân tích di truyền liên kết nhưng nhóm nghiên cứu chưa sàng lọc tỷ lệ dị hợp tử quan sát trên đối tượng người Việt Nam. Tiêu chuẩn lựa chọn chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán cần có tỷ lệ dị hợp tử quan sát >50% [6]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, những chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu của nhóm tác giả có tỷ lệ dị hợp tử quan sát rất thấp, thậm chí chỉ đạt 1,5% [6, 61].
Ưu điểm vượt trội của kỹ thuật phân tích di truyền liên kết sử dụng chỉ thị STR là giúp hạn chế ảnh hưởng do tỷ lệ nhân gen thất bại, tỷ lệ ADO: khi có nhiều chỉ thị liên kết với gen cần xác định đột biến, việc mất thông tin từ một số chỉ thị có thể được khắc phục nhờ thông tin bổ sung từ các chỉ thị khác. Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn được yêu cầu kiểm tra, đánh giá tỷ lệ ADO, tỷ lệ xác định kiểu gen thành công, thất bại trong thực hành, trước khi đưa vào chẩn đoán trước chuyển phôi. Trong báo cáo của nhóm tác giả, kỹ thuật chưa được đánh giá những chỉ số này trên 1 tế bào, trước khi tiến hành chẩn đoán trên 1 tế bào phôi. Đây là một trong những nhược điểm của nghiên cứu được nhóm tác giả thừa nhận trong phần bàn luận của công bố này [2].