Sau khi tiến hành chuyển phôi cho gia đình bệnh nhân, thai phụ được theo dõi và lấy mẫu ối (He180916 02-O) để chẩn đoán trước sinh khi thai nhi đạt 16 tuần tuổi. Kết quả phân tích di truyền liên kết cho mẫu dịch ối sử dụng bộ chỉ thị STR thiết kế được cho thấy thai nhi không mang allele F8 gây bệnh hemophilia A.
Kết quả đối chiếu bằng phương pháp Longrange-PCR thực hiện tại Viện Huyết học - Truyền máu TW cũng cho thấy không phát hiện đảo đoạn intron 22 ở mẫu dịch ối, đồng thời khẳng định thai nhi không mang allele F8 gây bệnh hemophilia A.
Hình 35. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng Longrange PCR do Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương thực hiện
Hình 37. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng phân tích di truyền liên kết sử dụng bộ STR thiết kế được
Như vậy, kết quả phân tích gián tiếp đột biến gen F8 thông qua các STR đa hình liên kết chặt với gen F8 trước chuyển phôi và trước sinh phù hợp với kết quả phân tích trực tiếp đột biến gen F8 bằng Longrange-PCR (Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương). Nghiên cứu của chúng tôi đã đạt được mục tiêu xây dựng bộ chỉ thị STR đảm bảo tính đa hình cao, liên kết chặt với gen F8, phục vụ chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi hemophilia A và áp dụng thành công cho gia đình bệnh nhân.
So với nghiên cứu trước đây ở Việt Nam cũng sử dụng phương pháp phân tích di truyền liên kết với chỉ thị STR để phục vụ PGT-M hemophilia A nhưng khuếch đại chỉ thị bằng PCR đơn mồi [2], nghiên cứu của chúng tôi có thời gian chẩn đoán nhanh và tiết kiệm kinh phí cũng như công lao động hơn trong khi vẫn đảm bảo tính chính xác nhờ kỹ thuật PCR đa mồi khuếch đại bộ chỉ thị trong cùng một phản ứng. Khi được áp dụng rộng rãi tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản, quy trình PGT trong nghiên cứu này sẽ góp phần giảm gánh nặng kinh tế cũng như tâm lý cho các gia đình có allele F8 gây bệnh. Các em bé được sinh ra sẽ không cần tiến hành sàng lọc gen bệnh hay tư vấn tiền hôn nhân khi đến tuổi trưởng thành.
Bên cạnh những ưu điểm trên, trong nghiên cứu vẫn có hiện tượng ADO ở một số chỉ thị STR trên các mẫu phôi được tiến hành chẩn đoán. Hình ảnh đỉnh kích thước sản phẩm điện di mao quản của mẫu phôi với tín hiệu không cao, hình dạng không điển hình cho thấy cần phải kiểm soát tốt hơn quy trình sinh thiết cũng như vận chuyển mẫu để đảm bảo chất lượng tế bào phôi. Trong giai đoạn áp dụng quy trình PGT cho các gia đình bệnh nhân, khi số lượng phôi được chẩn đoán đủ lớn, cần tiến hành thống kê để loại bỏ các chỉ thị có tỷ lệ ADO quá cao, tiếp tục tối ưu bộ chỉ thị để đảm bảo hiệu quả chẩn đoán.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã thiết lập thành công bộ chỉ thị gồm 13 STR đa hình cao và di truyền liên kết chặt chẽ với gen F8, phục vụ chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi.
2. Đã áp dụng thành công quy trình chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi từ bộ chỉ thị xây dựng được cho 01 gia đình bệnh nhân.
Kiến nghị
1. Mở rộng quy mô nghiên cứu chỉ số đa hình của các chỉ thị STR trong bộ thiết kế được trên các dân tộc khác nhau ở Việt Nam.
2. Áp dụng quy trình PGT-M hemophilia A xây dựng được tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt:
1. Lưu Vũ Dũng (2014), Nghiên cứu xác định đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A, Đại học Y Hà Nội.
2. Trần Vân Khánh, Phạm Lê Anh Tuấn, Nguyễn Quý Hoài, Nguyễn Thị Minh, Nguyễn Viết Tiến (2016), "Chẩn đoán tiền làm tổ bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật Microsattlite DNA", Tạp chí nghiên cứu Y Học, pp. 7.
3. Lê Nhật Minh, Võ Thị Thương Lan và Đỗ Trung Phấn (2004), "Sử dụng phương pháp ADN (PCR-RFLP) vùng intron 18 để xác định các cá thể mang gen bệnh máu khó đông Hemophilia A", Tạp chí Y học thực hành. 8, pp. 61 - 62.
4. Vũ Văn Quỳ (2010), Nghiên cứu tần suất alen của một số locus gen ở người Việt, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
5. Bạch Quốc Tuyên (1991), Nhân một trường hợp Hemophilia A có kháng thể kháng VIII- Bàn về kháng đông lưu hành, Bài giảng huyết học.
Tài liệu tiếng Anh:
6. Bagnall R., F. Giannelli and P. Green (2005), "Polymorphism and hemophilia A causing inversions in distal Xq28: a complex picture", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3(11), pp. 2598-2599.
7. Bagnall R. D., N. Waseem, P. M. Green and F. Giannelli (2002), "Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause of severe hemophilia A", Blood. 99(1), pp. 168-174.
8. Bogdanova N., A. Markoff, H. Pollmann, U. Nowak‐Göttl, R. Eisert, B. Dworniczak, A. Eigel and J. Horst (2002), "Prevalence of small rearrangements in the factor VIII gene F8C among patients with severe hemophilia A", Human mutation. 20(3), pp. 236-237.
9. Bogdanova N., A. Markoff, H. Pollmann, U. Nowak‐Göttl, R. Eisert, C. Wermes, A. Todorova, A. Eigel, B. Dworniczak and J. Horst (2005), "Spectrum of molecular defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A", Human mutation. 26(3), pp. 249-254.
10. Butler J. M. (2006), "Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing", Journal of forensic sciences. 51(2), pp. 253-265.
11. Butler J. M. (2007), "Short tandem repeat typing technologies used in human identity testing", Biotechniques. 43(4), pp. Sii-Sv.
12. Castaldo G., V. D'Argenio, P. Nardiello, F. Zarrilli, V. Sanna, A. Rocino, A. Coppola, G. Di Minno and F. Salvatore (2007), "Haemophilia A: molecular insights",
Clinical Chemical Laboratory Medicine. 45(4), pp. 450-461.
13. Chamberlain J. S., R. A. Gibbs, J. E. Rainer, P. N. Nguyen and C. Thomas (1988), "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification", Nucleic acids research. 16(23), pp. 11141-11156.
14. Cooke H. (1976), "Repeated sequence specific to human males", Nature. 262, pp. 182-186.
15. Cora N. I. R., F. I. Delgado, S. M. M. Ramírez and J. V. Quiñones (2017), "Acquired Hemophilia A in an advanced age patient of hispanic origin: a case report",
BMC research notes. 10(1), pp. 438.
16. Cumming A. (2004), "The factor VIII gene intron 1 inversion mutation: prevalence in severe hemophilia A patients in the UK", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2(1), pp. 205-206.
17. Ding Q., Y. Lu, J. Dai, X. Xi, X. Wang and H. Wang (2012), "Characterisation and validation of a novel panel of the six short tandem repeats for genetic counselling in Chinese haemophilia A pedigrees", Haemophilia. 18(4), pp. 621-625.
18. Eaton D., H. Rodriguez and G. A. Vehar (1986), "Proteolytic processing of human factor VIII. Correlation of specific cleavages by thrombin, factor Xa, and activated protein C with activation and inactivation of factor VIII coagulant activity",
Biochemistry. 25(2), pp. 505-512.
19. EL‐MAARRI O., U. Herbiniaux, J. Graw, J. Schröder, A. Terzic, M. Watzka, H. Brackmann, W. Schramm, P. Hanfland and R. Schwaab (2005), "Analysis of mRNA in hemophilia A patients with undetectable mutations reveals normal splicing in the factor VIII gene", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3(2), pp. 332-339.
20. Fisch E., E. Fricke, S. Baedker, U. Deutsch, R. Ahmed, D. Loeffert and C. Korfhage (2014), "Accurate Genome Analysis of Single Cells", Journal of Biomolecular Techniques : JBT.
21. Forman E. J., K. H. Hong, K. M. Ferry, X. Tao, D. Taylor, B. Levy, N. R. Treff and R. T. Scott Jr (2013), "In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial", Fertility and sterility. 100(1), pp. 100-107. e1.
22. Franchini M., M. Montagnana, G. Targher, D. Veneri, M. Zaffanello, G. L. Salvagno, F. Manzato and G. Lippi (2009), Interpatient phenotypic inconsistency in severe congenital hemophilia: a systematic review of the role of inherited thrombophilia, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr. 307-312.
23. Ganguly A., T. Dunbar, P. Chen, L. Godmilow and T. Ganguly (2003), "Exon skipping caused by an intronic insertion of a young Alu Yb9 element leads to severe hemophilia A", Human genetics. 113(4), pp. 348-352.
24. Gawad C., W. Koh and S. R. Quake (2016), "Single-cell genome sequencing: current state of the science", Nature Reviews Genetics. 17(3), pp. 175.
25. Goodeve A. (2008), Molecular genetic testing of hemophilia A, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr. 491-501.
26. Goodeve A. C., I. Williams and G. L. Bray (2000), "Relationship between factor VIII mutation type and inhibitor development in a cohort of previously untreated patients treated with recombinant factor VIII (Recombinate™)", Thrombosis and haemostasis. 83(6), pp. 844-848.
27. Graw J., H.-H. Brackmann, J. Oldenburg, R. Schneppenheim, M. Spannagl and R. Schwaab (2005), "Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies",
Nature Reviews Genetics. 6(6), pp. 488-501.
28. Griffin D. K., L. J. Wilton, A. H. Handvside, R. M. Winston and J. D. Delhanty (1992), "Dual fluorescent in situ hybridisation for simultaneous detection of X and Y chromosome-specific probes for the sexing of human preimplantation embryonic nuclei", Human genetics. 89(1), pp. 18-22.
29. Griffin D. K., L. J. Wilton, A. H. Handyside, G. Atkinson, R. Winston and J. Delhanty (1993), "Diagnosis of sex in preimplantation embryos by fluorescent in situ hybridisation", BMJ: British Medical Journal. 306(6889), pp. 1382.
30. Grifo J. A., B. Hodes-Wertz, H.-L. Lee, E. Amperloquio, M. Clarke-Williams and A. Adler (2013), "Single thawed euploid embryo transfer improves IVF pregnancy, miscarriage, and multiple gestation outcomes and has similar implantation rates as egg donation", Journal of assisted reproduction and genetics. 30(2), pp. 259-264. 31. Guo X. and R. J. H. h. Elston (1999), "Linkage information content of polymorphic genetic markers". 49(2), pp. 112-118.
32. Harton G., M. De Rycke, F. Fiorentino, C. Moutou, S. SenGupta, J. Traeger- Synodinos and J. J. H. r. Harper (2010), "ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD". 26(1), pp. 33-40.
33. High K. A. (2012), "The gene therapy journey for hemophilia: are we there yet?",
ASH Education Program Book. 2012(1), pp. 375-381.
34. Hoffbrand V. and P. A. Moss (2011), Essential haematology, Vol. 28, John Wiley & Sons.
35. Huang J., J. Pang, T. Watanabe, H.-K. Ng and H. Ohgaki (2009), "Whole genome amplification for array comparative genomic hybridization using DNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded histological sections", The Journal of Molecular Diagnostics. 11(2), pp. 109-116.
36. Jayandharan G. R. and A. Srivastava (2008), The phenotypic heterogeneity of severe hemophilia, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr. 128-141.
37. Justice U. D. o. (2002), Using DNA to Solve Cold Cases, National Commission on the Future of DNA Evidence.
38. Keeney S., M. Mitchell and A. Goodeve (2010), Practice Guidelines for the Molecular Diagnosis of Haemophilia A, chủ biên, UK Haemophilia Centre Doctors’ Organisation, CMGS Website.
39. Kemball-Cook G., E. G. Tuddenham and A. I. Wacey (1998), "The factor VIII structure and mutation resource site: HAMSTeRS version 4", Nucleic acids research. 26(1), pp. 216-219.
40. Kogan S. C., M. Doherty and J. Gitschier (1987), "An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequences", New England Journal of Medicine. 317(16), pp. 985-990.
41. Lakich D., H. H. Kazazian, S. E. Antonarakis and J. Gitschier (1993), "Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A", Nature genetics. 5(3), pp. 236-241.
42. Laurie A., A. Hill, J. Harraway, A. Fellowes, G. Phillipson, P. Benny, M. Smith and P. George (2010), "Preimplantation genetic diagnosis for hemophilia A using indirect linkage analysis and direct genotyping approaches", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8(4), pp. 783-789.
43. Liu J., Q. Liu, Y. Liang, L. Wang, G. Nozary, B. Xiao, Z. Zhu, Y. Zhou, L. Liu and Y. Guan (1999), "PCR assay for the inversion causing severe Hemophilia A and its application", Chinese medical journal. 112(5), pp. 419-423.
44. Liu Q., G. Nozari and S. S. Sommer (1998), "Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in hemophilia A",
Blood. 92(4), pp. 1458-1459.
45. Liu Q. and S. S. Sommer (1998), "Subcycling-PCR for multiplex long-distance amplification of regions with high and low GC content: application to the inversion hotspot in the factor VIII gene", Biotechniques. 25(6), pp. 1022-1028.
46. Lodish H. (2004), Molecular Cell Biology, 5th, ed.
47. Machado F. and E. MEDINA‐ACOSTA (2009), "High‐resolution combined linkage physical map of short tandem repeat loci on human chromosome band Xq28 for indirect haemophilia A carrier detection", Haemophilia. 15(1), pp. 297-308. 48. Mannucci P. M., R. E. Schutgens, E. Santagostino and E. P. Mauser-Bunschoten (2009), "How I treat age-related morbidities in elderly persons with hemophilia",
49. Mansouritorghabeh H., L. Manavifar, A. Banihashem, A. Modaresi, A. Shirdel, M. Shahroudian, G. Shoja-e-Razavi, H. Pousti and H. Esmaily (2013), "An investigation of the spectrum of common and rare inherited coagulation disorders in North-Eastern Iran", Blood Transfusion. 11(2), pp. 233.
50. Massaro J., C. Wiezel, Y. Muniz, E. Rego, L. De Oliveira, C. MENDES‐JUNIOR and A. Simões (2011), "Analysis of five polymorphic DNA markers for indirect genetic diagnosis of haemophilia A in the Brazilian population", Haemophilia. 17(5), pp. e936-e943.
51. Mirchandani G. G., J. H. Drake, S. L. Cook, B. C. Castrucci, H. S. Brown and C. P. Labaj (2011), "Surveillance of bleeding disorders, Texas, 2007", American journal of preventive medicine. 41(6), pp. S354-S359.
52. MRC-Holland (2008), MRC-Holland,, truy cập ngày 29/9-2016, tại trang.
53. Mühle C., M. Zenker, N. Chuzhanova and H. Schneider (2007), "Recurrent inversion with concomitant deletion and insertion events in the coagulation factor VIII gene suggests a new mechanism for X‐chromosomal rearrangements causing hemophilia A", Human mutation. 28(10), pp. 1045-1045.
54. Myrin‐Westesson L., F. Baghaei and F. Friberg (2013), "The experience of being a female carrier of haemophilia and the mother of a haemophilic child", Haemophilia. 19(2), pp. 219-224.
55. Nakaya S., T. C. Hsu, S. Geraghty, M. Manco‐Johnson and A. Thompson (2004), "Severe hemophilia A due to a 1.3 kb factor VIII gene deletion including exon 24: homologous recombination between 41 bp within an Alu repeat sequence in introns 23 and 24", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2(11), pp. 1941-1945.
56. Nei M. and A. K. Roychoudhury (1974), "Sampling variances of heterozygosity and genetic distance", Genetics. 76(2), pp. 379-390.
57. Oldenburg J., V. Ivaskevicius, S. Rost, A. Fregin, K. White, E. Holinski-Feder, C. R. Müller and B. H. Weber (2001), "Evaluation of DHPLC in the analysis of hemophilia A", Journal of biochemical and biophysical methods. 47(1), pp. 39-51.
58. Oldenburg J., J. Schröder, H. H. Brackmann, C. Müller-Reible, R. Schwaab and E. Tuddenham (2004), Environmental and genetic factors influencing inhibitor development, Seminars in hematology, Elsevier, tr. 82-88.
59. Oldenburg J., J. Schröder, J. Graw, V. Ivaskevicius, H. Brackmann, W. Schramm, C. Müller, E. Seifried and R. Schwaab (2003), "[Significance of mutation analysis in patients with haemophilia A]", Hamostaseologie. 23(1), pp. 6-12.
60. Peng W., H. Takabayashi and K. Ikawa (2007), "Whole genome amplification from single cells in preimplantation genetic diagnosis and prenatal diagnosis",
European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 131(1), pp. 13-20.
61. Peyvandi F., G. Jayandharan, M. Chandy, A. Srivastava, S. Nakaya, M. Johnson, A. Thompson, A. Goodeve, I. Garagiola and S. Lavoretano (2006), "Genetic diagnosis of haemophilia and other inherited bleeding disorders", Haemophilia. 12(s3), pp. 82-89.
62. Piyamongkol W., M. G. Bermúdez, J. C. Harper and D. Wells (2003), "Detailed investigation of factors influencing amplification efficiency and allele drop‐out in single cell PCR: implications for preimplantation genetic diagnosis", Molecular Human Reproduction. 9(7), pp. 411-420.
63. Poláková H., I. Zmetáková and L. Kádasi (2003), "Long distance PCR in detection of inversion mutations of F8C gene in hemophilia A patients", General physiology and biophysics. 22(2), pp. 243-254.
64. QIAGEN (2017), NGS using Whole Genome Amplified DNA, chủ biên.
65. Radal K. (1995), Structure and Biology of factor VIII, Hematology: Basic principles and practice, Vol. 2.
66. Ray P., R. Winston and A. Handyside (1995), Single cell analysis for diagnosis