Nghiên cứu được tiến hành theo 2 giai đoạn: giai đoạn đầu nhằm xác định tính đa hình của các STR trong bộ chỉ thị thiết kế được. Giai đoạn thứ 2 nhằm tối ưu hóa các bước thực hiện để xây dựng quy trình PGT hemophilia A áp dụng quy trình xây dựng được cho gia đình bệnh nhân.
Lựa chọn các STR phục vụ chuẩn đoán Tối ưu phản ứng nhân bản STR trên thực nghiệm Xác định PIC, Ho, He của các chỉ thị STR Lựa chọn được bộ STR cho chẩn đoán hemophilia A Xây dựng quy trình phân tích STR trên phôi bào Thực hiện PGT trên gia đình mang gen
Chuyển phôi và theo dõi mang thai
Chẩn đoán trước sinh kiểm tra kết quả
Xây dựng và áp dụng quy trình PGT hemophilia A Xác định tính đa hình của các STR liên kết gen F8
2.3. Hóa chất và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
*Hóa chất dùng để tách chiết DNA: QIAGEN blood Minikit; cồn tuyệt đối dùng trong thí nghiệm sinh học phân tử Merk
*Hóa chất dùng để khuếch đại toàn hệ gen tế bào: REPLI-g Single Cell Kit QIAGEN
*Hóa chất để thực hiện kỹ thuật PCR: QIAGEN Multiplex PCR 2X Mastermix; QIAGEN Q-Solution; Các cặp mồi (IDT)
*Hóa chất để điện di agarose sản phẩm PCR: Bột Agarose LE (Roche); TBE Buffer 10X (Serva); Agarose gel loading dye 6x (Intron); 100bp Ladder (Norgen); RedSafe Nucleic Acid staining solution (Intron)
*Hóa chất để điện di mao quản sản phẩm PCR: CE Running buffer 10X (MCLAB),
Nano POP4 dùng cho máy ABI3130/3130XL (MCLAB), Size standard Genscan 500LIZ (Thermo Fisher Scientific), Hi-Di Formamide (Thermo Fisher Scientific)
*Dụng cụ: Ống Eppendorf 1,5 ml - 0,5 ml - 0,2 ml; Ống lấy máu chống đông EDTA; Găng tay vô khuẩn; Khẩu trang y tế; Hộp giữ mẫu; Pipet, đầu tips các loại dùng cho kỹ thuật sinh học phân tử
*Thiết bị: Máy Proflex PCR System (Thermo Fisher Scientific); Máy đo NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific); Máy đo Qubit 3.0 Fluorometric Quantitation (Life Technologies); Bộ điện di NANOPAC 300P (Cleaver); Tủ lạnh sâu: -20oC, -80oC (Panasonic); Máy ly tâm lạnh Hitech và ly tâm để bàn Boeco; Máy giải trình tự gen ABI Prism 3130XL Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific); Tủ an toàn sinh học cấp II dùng trong sinh học phân tử; Máy ủ nhiệt và lắc MTH – 100 (Holdwell); Máy lắc MS3 basic (IKA); Cân điện tử Practum (Sartorius)
2.4. Các kỹ thuật được sử dụng
2.4.1. Giai đoạn tối ưu và xác định tính đa hình
2.4.1.1. Kỹ thuật sàng lọc chỉ thị STR
Sử dụng cơ sở dữ liệu STR và phần mềm Tandem Repeat Finder (TRF) cung cấp bởi Gary Benson và cộng sự (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html) để tiến hành sàng lọc chỉ thị xác định đột biến gen F8 theo tiêu chuẩn hướng dẫn bởi Machado năm
2009 [47], sử dụng trình tự tham chiếu cho NST X của người trên NCBI với mã truy cập NC_000023: cài đặt thông số align bao gồm Match: 2, Mismatch: 2, Indels: 7; vị trí tìm kiếm cách 1Mbp về phía trước, sau gen F8 và trong gen; tiêu chí chọn lọc: số lần lặp trình tự từ 2 đến 6 với điểm Align thấp nhất với trình tự trên NST X tương ứng là 54, 80, 66, 52 (là điểm thấp nhất của các chỉ thị nội gen F8 có số lần lặp như vậy và được đánh giá là có giá trị đa hình di truyền thông qua xác định kiểu gen trực tiếp), % Match ≥ 80.
Hình 13. Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để sàng lọc
Để lựa chọn hệ thống chỉ thị STR có thể sử dụng trên quần thể người Việt Nam: từ những STR đã sàng lọc được từ phần mềm TRF, dựa trên dữ liệu được báo cáo từ các nghiên cứu đã tiến hành trên quần thể người Brazil [47, 50], New Zealand [42], Trung Quốc [17, 72], tiếp tục chọn ra các chỉ thị STR có các chỉ số PIC, H(exp), H(ob) > 0,5 và có mồi khuếch đại đáp ứng yêu cầu khuyến cáo của QIAGEN bao gồm: kích thước 20 – 30 nucleotide, nhiệt độ Tm ≥ 60oC, có không quá 3 nucleotide G hoặc C ở đầu 3’ và 2 mồi không bắt cặp nhau ở đầu 3’. Tiếp tục chọn lọc theo kích thước sản phẩm khuếch đại sao cho các sản phẩm cách nhau khoảng 10 nucleotide, từ đó xác định kích thước sản phẩm nhỏ nhất và chia làm các nhóm với khoảng cách sản
phẩm khuếch đại là 10 nucleotide. Cuối cùng chọn chỉ thị đại diện sao cho tổng thể có cả chỉ thị trước, trong và sau gen F8.
Sau khi lựa chọn được các STR và mồi khuếch đại đáp ứng tiêu chí sàng lọc, sử dụng công cụ In-silico PCR tại https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr với hệ gen tham chiếu là GRCh38/hg38 kết hợp phần mềm so sánh trình tự BLAST trên NCBI nhằm xác định sơ bộ các allel của loci để loại bỏ các chỉ thị có trình tự mồi bắt cặp với các đoạn lặp Alu và các trình tự không đặc hiệu trên NST khác, sau đó gắn huỳnh quang cho một mồi trong mỗi cặp sao cho các sản phẩm của các mồi cùng màu huỳnh quang có thể phân biệt được với nhau.
2.4.1.2. Kỹ thuật tách DNA
Sử dụng QIAGEN blood Minikit theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể như sau:
Chuẩn bị hóa chất trước thí nghiệm: Tất cả hóa chất phải đưa về 15-25oC trước khi sử dụng. Lắc kỹ các lọ hóa chất trước khi tiến hành quy trình.Đặt nhiệt độ của block máy ủ nhiệt ở 70oC trước khi tiến hành thí nghiệm. AW1, AW2 được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Thực hiện quy trình: Cho 20 µl proteinase vào ống Eppendorf 1,5 ml. Tiếp theo cho 200 µl mẫu (máu, dịch ối) và 200 µl AL vào ống, đóng nắp, vortex 15 giây.Ủ lắc ở 60oC trong 15 phút. Thêm tiếp 200 µl cồn tuyệt đối vào ống, đóng nắp, vortex 15 giây. Sau đó chuyển toàn bộ hỗ dịch ở bước 4 vào cột lọc QIAamp, không làm ướt mép ống, đóng nắp, ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút; đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa dịch lọc đi.Mở nắp cột lọc, thêm 500 µl AW1, không làm ướt mép cột, đóng nắp, ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút, đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa dịch lọc đi. Mở nắp cột lọc, thêm 500 µl AW2, không làm ướt mép cột, đóng nắp, ly tâm ở 18000 vòng/phút trong 2 phút, đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa dịch lọc đi.Ly tâm ở 18000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ ống 2 ml. Đặt cột lọc vào ống Eppendorf 1,5 ml sạch, thêm 50 µl AE buffer vào trung tâm của màng lọc, không chạm vào màng lọc; ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Cuối cùng ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA hòa tan từ màng lọc.Bảo quản ở 2-8oC và thực hiện phản ứng trong cùng ngày tách.
2.4.1.3. Kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen
Sử dụng REPLI-g Single Cell Kit QIAGEN (USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể như sau: rã đông REPLI-g sc DNA Polymerase trên đá, các hóa chất còn lại rã đông ở nhiệt độ phòng, trong đó buffer D2 pha sẵn phải được sử dụng trong vòng 3 tháng. Bổ sung 500µl H2O vào ống Buffer DLB trước khi sử dụng (sau khi pha loãng phải sử dụng trong vòng 6 tháng và lưu trữ ở -20oC). Nếu sử dụng máy luân nhiệt (PCR) thay cho bể ổn nhiệt, cài đặt nhiệt độ làm nóng nắp block ở 70OC. Sau đó thực hiện quy trình bao gồm các bước: cho 4 µl dung dịch PBS chứa tế bào vào ống PCR. Nếu thể tích mẫu ban đầu ít hơn 4µl, bổ sung thêm PBS để thu được tổng dung dịch chứa tế bào là 4 µl. Chuẩn bị Buffer D2 (Denaturation buffer) theo bảng 4. Thêm 3 µl Buffer D2 vào mỗi ống. Búng nhẹ để trộn và ly tâm ngắn để thu dung dịch về đáy ống. Ủ ở 65oC trong 10 phút. Sau đó thêm 3 µl Stop Solution vào mỗi ống rồi búng nhẹ để trộn và ly tâm ngắn để thu dung dịch về đáy ống. Đặt trên đá lạnh/khay lạnh. Rã đông REPLI- g sc DNA Polymerase trên đá và các hóa chất khác ở nhiệt độ phòng và chuẩn bị Mastermix theo bảng 5 (đã lấy dư). Thêm 40 µl mastermix vào mỗi ống. Cài đặt chu trình nhiệt bao gồm: 30OC trong 8 giờ, 65OC trong 3 phút và lưu trữ ở 4OC. Cài đặt nắp block nhiệt ở 70oC, lưu trữ và bảo quản mẫu ở -20OC.
Bảng 4. Thành phần D2 Số ống phản ứng DTT, 1M (µl) Buffer DLB (µl) 1 0,25 2,75 12 3 33 24 6 66 25 6,25 68,75 26 6,5 71,5
Bảng 5. Thành phần Mastermix Số ống phản ứng H2O (µl) REPLI-g sc React. Buffer (µl) REPLIC-g sc DNA Polymerase (µl) 1 9 29 2 2 19,8 63,8 4,4 3 29,7 95,7 6,6 4 39,6 127,6 8,8 5 49,5 159,5 11 6 59,4 191,4 13,2 7 69,3 223,3 15,4 8 79,2 255,2 17,6 9 89,1 287,1 19,8 10 99 319 22 11 108,9 350,9 24,2 12 118,8 382,8 26,4 13 122,85 395,85 27,3 14 132,3 426,3 29,4 15 141,75 456,75 31,5 16 151,2 487,2 33,6
Kiểm tra nồng độ DNA sau WGA:
Nồng độ của sản phẩm khuếch đại hệ gen được tính bằng cách đo nồng độ của mẫu sản phẩm pha loãng sau đó nhân hệ số để có nồng độ gốc. Các sản phẩm bước WGA được pha loãng tỷ lệ 1:10 trước khi tiến hành đo. Chuẩn bị dung dịch Qubit working solution theo tỷ lệ: 1 µl reagent (dye): 100 µl Buffer. Bổ sung 190 µl dung dịch Qubit working solution vào các ống 0,5ml mới đã chuẩn bị trước đó. Tiếp tục thêm 10 µl chất chuẩn 1 và 2 vào hai ống 0,5 ml đã chứa 190 µl dung dịch Qubit working solution. Các ống còn lại được bổ sung thêm 10 µl các mẫu đã pha loãng
tương ứng. Trộn đều các ống bằng vortex và ly tâm nhanh. Chuẩn máy đo Qubit sử dụng 2 ống chất chuẩn vừa chuẩn bị và đo các mẫu rồi ghi lại nồng độ các mẫu.
2.4.1.4. Kỹ thuật PCR đa mồi
Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi: sau khi sử dụng công cụ http://sg.idtdna.com/calc/analyzer xác định được nhiệt độ nóng chảy Tm từ đó tính toán nhiệt độ gắn mồi trung bình của tất cả các cặp mồi, tiến hành phản ứng PCR cho riêng mỗi cặp mồi theo gradient nhiệt độ gắn mồi trung bình với khoảng cách 5oC. Dựa trên kết quả điện di trên gel agarose 2% (120V trong 30 phút) tiếp tục tối ưu bằng gradient nhiệt độ với bước nhảy 1oC.
Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi (tổng thể tích phản ứng 20µl)
Thành phần Nồng độ Thể tích (µl/ ống)
HPLC Water 7,2
2X QIAGEN Multiplex MasterMix 1X 10
Primer F 0,2 µM 0,4
Primer R 0,2 µM 0,4
DNA Template 2
Bảng 7. Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR đơn mồi
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95 0C 5 phút 1
94 0C 30 giây
40 Dải nhiệt độ tối ưu hóa 0C 30 giây
72 0C 45 giây
72 0C 5 phút 1
11 0C ∞ 1
Tối ưu hóa nồng độ mồi: từ nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho tất cả các cặp mồi đã xác định khi tối ưu hóa ở giai đoạn trước, tiến hành ghép các mồi vào cùng 1 ống phản ứng để từ đó điều chỉnh nồng độ mồi bằng cách tăng nồng độ các cặp hoạt động yếu, giảm nồng độ các cặp hoạt động mạnh theo gradient 0,05 µM dựa trên cường độ tín
hiệu sản phẩm khuếch đại phân tích được trên gel agarose.
Sau khi xác định được nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi tối ưu, tiến hành PCR đa mồi để khuếch đại đồng thời các STR. Sau đó tiếp tục PCR đa mồi gắn huỳnh quang cho các sản phẩm để phục vụ điện di mao quản theo thành phần phản ứng bảng 8 và chu trình nhiệt bảng 9.
Bảng 8. Thành phần phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang
Thành phần Nồng độ Thể tích/ 1 ống phản ứng
HPLC H20 6.80 ul
Qiagen PCR Master Mix 1 X 10.00 ul
Sản phẩm PCR vòng trước 2.00 ul
Các mồi Nồng độ Thể tích/ 1 ống phản ứng
M13 (-20) 0.2 uM 0.4 ul
M13 (-41) 0.2 uM 0.4 ul
M13 (CM) 0.2 uM 0.4 ul
Bảng 9. Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95 oC 15 phút 1 94 oC 30 giây 10 60 oC 90 giây 72 oC 60 giây 60 oC 30 phút 1 Bảo quản ở 11oC
Bảng 10. Thông tin mồi huỳnh quang STT Trình tự Mã hóa Màu huỳnh quang 1 5’-/56-FAM/GGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ M13-41 FAM 2 5’-/5HEX/GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ M13-20 HEX 3 5’-/NED/CATGGTCATAGCTGTTTCCTG M13-CM NED
2.4.1.5. Kỹ thuật điện di mao quản
Tiến hành điện di mao quản sản phẩm PCR thu được để phân tích kích thước các STR trong mẫu DNA theo các thành phần và điều kiện ở Bảng 11, 12.
Bảng 11. Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản
Thành phần Thể tích/ 1 ống phản ứng
Hi-Di 8.50 ul
GS500 LIZ 0.50 ul
DNA Templates 1.00 ul
Bảng 12. Chu trình nhiệt biến tính DNA
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95o C 5 min 1
Kết quả điện di mao quản được phân tích bằng phần mềm Genemapper version 4.0. Việc xác định các đỉnh tín hiệu phù hợp cho mỗi STR dựa trên thang kích thước chuẩn từ cơ sở dữ liệu đã được công bố bởi Machado và cộng sự năm 2009 [47].
2.4.1.6. Tính toán chỉ số đa hình
Phần mềm Genemapper version 4.0 cho phép hiển thị kết quả điện di mao quản dưới dạng hình ảnh các đỉnh tín hiệu sản phẩm khuếch đại với độ cao của đỉnh tương ứng nồng độ sản phẩm, và kích thước sản phẩm theo bp như minh họa ở hình 15.
Hình 14. Giao diện phân tích kết quả phần mềm Genemapper 4.0.
Sau khi thu thập dữ liệu về kích thước sản phẩm khuếch đại của các mẫu, tiến hành tính toán các tần số dị hợp tử Ho, He và hàm lượng thông tin tính đa hình PIC theo các công thức cụ thể như sau [31]:
Tần số dị hợp tử quan sát (Observed Heterozygosity – Ho): là tổng tần số các kiểu gen dị hợp tử quan sát được trong toàn bộ mẫu nghiên cứu.
Ho= Số cá thể dị hợp tử Tổng số cá thể quan sát
Tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected Heterozygosity – He):
He=1 -∑Pi2
k
i=1
Trong đó: k là tổng số allele nghiên cứu; Pi là tần số của allele thứ i trong tổng số k allele.
Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content – PIC): PIC = 1 -∑Pi2- ∑ ∑2Pi2Pj2 k j=i+1 k-1 i=1 k i=1
Trong đó: Pi, Pi là tần số allele thứ i và j trong tổng số k allele của locus nghiên cứu.
2.4.2. Giai đoạn áp dụng và phân tích di truyền trước chuyển phôi 2.4.2.1. Kỹ thuật ICSI 2.4.2.1. Kỹ thuật ICSI
Kỹ thuật ICSI được thực hiện tại Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội với quy trình như sau: bệnh nhân được khám, tư vấn, làm các xét nghiệm cơ bản, và xét nghiệm nội tiết tố sinh dục, siêu âm đếm nang thứ cấp vào ngày 2 của vòng kinh. Hồ sơ được hoàn thành ngay sau khi đủ kết quả, và được duyệt ngay trong tuần. Sau đó, tùy từng trường hợp, bệnh nhân sẽ được kích thích buồng trứng với phác đồ phù hợp [84].
2.4.2.2. Kỹ thuật sinh thiết phôi
Các phôi thụ tinh trong ống nghiệm đạt mốc thời gian 5 ngày tuổi (khoảng 60 tế bào) sẽ được sinh thiết sử dụng tia lase để lấy ra khoảng 3 đến 5 tế bào bởi các chuyên viên phôi học tại phòng nuôi cấy phôi Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội. Các tế bào này sẽ được chuyển về phòng thí nghiệm DNA thuộc Bộ môn Giải phẫu của Học viện Quân Y để kiểm tra bất thường về mặt di truyền. Trước khi chuyển phôi bào ra khỏi phòng nuôi cấy, phôi bào cần được trải qua bước rửa phôi để loại bỏ các mảnh vụn tế bào vòn sót lại trong quá trình sinh thiết cũng như loại bỏ các cặn bẩn trong môi trường còn sót lại.
2.4.2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử
Các kỹ thuật tách DNA, WGA, PCR đa mồi và điện di mao quản được tiến hành tương tự như mô tả ở mục 2.4.1 với các yếu tố nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và số chu kỳ khuếch đại đã được tối ưu hóa.
2.4.2.5. Kỹ thuật phân tích di truyền liên kết trên mẫu phôi
Để kết luận tình trạng phôi, cần so sánh kích thước các STR khuếch đại từ mẫu phôi so với mẫu DNA của bố, mẹ và người thân bị bệnh. Theo nguyên tắc phân tích di truyền liên kết, kích thước STR khuếch đại từ mẫu phôi và DNA của con/ người