Bƣớc 1: Chuẩn bị các chủng nấm gây bệnh đích: Nấm gây bệnh thán thƣ (Colletotrichum gloeosporiodes) hoặc nấm gây bệnh thối xám (Botrytis cinera),… Các chủng nấm sạch đƣợc hoạt hóa ở dạng sợi nấm.
Bƣớc 2: Chuẩn bị các nồng độ dịch chiết muốn kiểm tra hoạt tính. Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy: agar 15g, malt extract 15g, chloramphenicol 0,2g, nƣớc cất 1l. Môi trƣờng đƣợc chia đều ra các bình tam giác nhỏ đem hấp khử trùng và trộn các dung dịch chất cần kiểm tra hoạt tính vào trong môi trƣờng Malt extract rồi đổ vào đĩa petri. Khả năng ức chế của các chất đƣợc đánh giá ở nồng độ khác nhau tùy từng đối tƣợng chất thử. Thông thƣờng đối với dịch chiết tổng ta thử ở 1500 ppm, phân đoạn dịch chiết thử ở 1000 ppm, chất sạch đƣợc thử ở 200 ppm.
Bƣớc 4: Cấy miếng nấm khảo nghiệm có đƣờng kính 4 mm vào tâm đĩa môi trƣờng. Các mẫu thí nghiệm đƣợc nuôi ở nhiệt độ 24 OC, đo kích thƣớc tản nấm sau 5 ngày nuôi cấy (hoặc khi mẫu đối chứng âm ăn kín đĩa thạch)
Đánh giá khả năng ức chế theo công thức: C – T
KNƢC % = --- x 100 C
Trong đó:
KNƢC %: Khả năng ức chế của dịch chiết với nấm T: Đƣờng kính tản nấm ở công thức thí nghiệm C: Đƣờng kính tản nấm ở công thức đối chứng âm
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập và sinh khối nấm nội sinh.
3.1.1. Kết quả thu hái và xử lý mẫu thí nghiệm.
Mẫu nghệ vàng (Curcuma longa L.) đƣợc định tên bởi nhà thực vật học: Nguyễn Kim Đào – Viện Sinh thái Tài nguyên và Sinh vật. Mẫu thí nghiệm đƣợc mô tả trong hình 3.1.
Hình 3.1: Hình ảnh mẫu nghệ vàng (Curcuma longa)
Sử lý sơ bộ mẫu nghệ thu hái:
Hình 3.2: Thu hái mẫu nghệ vàng
Sau khi xử lý sơ bộ các mẫu nghệ đƣợc xịt cồn 70% trƣớc khi đƣa vào box cấy. Các mẫu đƣợc cắt nhỏ theo cấu tạo của các bộ phận mẫu cây và
ngâm ngập trong cốc cồn 70% trong 90-120 giây sau đó chuyển mẫu sang cốc nƣớc thanh trùng ngâm ngập trong 120 giây. Mẫu khử trùng xong đƣợc để ráo tự nhiên hoặc đặt trên giấy/khăn lau đã khử trùng.
• Củ: để nguyên nhánh nhỏ.
• Rễ: lấy đoạn rễ dài khoảng 6-8 cm.
• Thân: cắt thành từng đoạn ngắn dài 5-6 cm. • Lá: cắt thành miếng 8x8 cm.
Hình 3.3: Khử trùng các mẫu nghệ trong phân lập nấm nội sinh.
3.1.2. Kết quả phân lập nấm nội sinh.
Kiểm tra công thức khử trùng: cấy mẫu đối chứng bằng cách quệt hoặc lăn mẫu đã khử trùng lên trên bề mặt thạch sao cho bề mặt các mẫu cây đƣợc tiếp xúc với bề thạch nhiều nhất (mẫu đối chứng) .
Mẫu khử trùng đã đƣợc cấy mẫu đối chứng tiến hành cắt tại các vị trị đã đặt tiếp xúc với bề mặt thạch và cấy lên bề mặt thạch sao cho vị trí cắt đƣợc tiếp xúc với bề mặt thạch nhiều nhất (mẫu thí nghiệm – mẫu phân lập). • Củ: cắt lát mỏng, lấy các mẫu chứa cả vỏ.
• Rễ: cắt thành đoạn dài 1 cm. • Thân: cắt lát mỏng ngang thân.
• Lá: cắt thành miếng với kích thƣớc khoảng 1x1 cm
Hình 3.5: Mẫu thí nghiệm (mẫu lá, c nuôi cấy phân lập nấm nội sinh)
Các mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm đƣợc bọc kín bằng paraffin. Tiến hành nuôi mẫu trong điều kiện 24 OC. Sau 48h có thể kiểm tra mẫu : mẫu đối chứng không có gì (vi sinh vật không xuất hiện trên môi trƣờng nuôi cấy) chứng tỏ khử trùng mẫu đã sạch; mẫu đối chứng có dấu hiệu nấm phát triển chứng tỏ khử trùng mẫu chƣa sạch hoặc sinh vật của mẫu tại những điểm bị tổn thƣơng, cần tiến hành lại thí nghiệm với loại mẫu này.
Sau 2-3 ngày nuôi cấy sợi nấm bắt đầu phát triển trên bề mặt thạch, khi xuất hiện các sợi nấm mọc trên đĩa thạch cần tiến hành cấy chuyển luôn, tránh hiện tƣợng mọc lẫn nhau của 2 hay nhiều chủng nấm. Sử dụng que cấy đầu tròn gạt nhẹ qua các sợi nấm và cấy sang đĩa thạch mới theo hình cửa xếp.
Theo dõi sự phát triển của nấm và các mẫu đối chứng, mẫu thí nghiệm trong 2-3 tuần. Đồng thời cấy chuyển nhiều lần đến khi chủng nấm đƣợc sạch, tiến hành phân loại của chủng nấm rồi mới tiến hành sinh khối lƣợng lớn.
Kết quả thu đƣợc 17 chủng nấm nội sinh khác nhau dựa vào nguồn gốc và hình thái bằng mắt thƣờng trong quá trình nuôi cấy. Các mẫu nấm nội sinh đƣợc kí hiệu theo tên chữ cái.
+ Ch ng nấm A:
Nguồn gốc phân lập: củ và rễ nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm dầy, sợi khí sinh phát triển kém. Ban đầu sợi nấm màu trắng, khi già sợi nấm màu trắng vàng rồi ngả sang mầu hồng trắng. Có nhiều vòng tròn đồng tâm, dạng hạt.
Hình 3.6: Ch ng nấm A + Ch ng nấm B1:
Nguồn gốc phân lập: củ cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm phát triển mạnh và ăn đều từ tâm ra xung quanh. Sợi khí sinh phát triển tốt. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu tím đỏ.
+ Ch ng nấm B2:
Nguồn gốc phân lập: củ cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm phát triển khá tốt, sợi khí sinh phát triển có màu trắng. Nhìn phía dƣới bề mặt thạch sợi nấm kị khí có màu vàng trắng.
Hình 3.8: Ch ng nấm B2 + Ch ng nấm C:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ. Đặng điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, có màu trắng. Bào tử có màu vàng, khi già chuyển sang mà xanh.
Hình 3.9: Ch ng nấm C + Ch ng nấm D:
Nguồn gốc phân lập: lá cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển và hình thành các đám bông. Sợi kị khí có sự phân nhánh nhƣ rễ cây. Sợi nấm có màu xám trắng.
+ Ch ng nấm E:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, mọc phân tán đều từ tâm ra xung quanh. Sợi kỵ khí có màu đen, có hình các vòng tròn đồng tâm khi nhìn úp đĩa thạch.
Hình 3.11: Ch ng nấm E + Ch ng nấm F:
Nguồn gốc phân lập: lá cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, bông, có màu trắng.
Hình 3.12: Ch ng nấm F + Ch ng nấm G:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, có màu trắng, khi già có mầu nâu trắng.
+ Ch ng nấm H:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, ban đầu màu xám trắng sau đó chuyển màu nâu.
Hình 3.14: Ch ng nấm H + Ch ng nấm I:
Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm phát triển chậm, sợi khí sinh có màu trắng, sợi kỵ khí phát triển chia nhánh giống hình cây thông có màu nâu đỏ.
Hình 3.15: Ch ng nấm I + Ch ng nấm J:
Nguồn gốc phân lập: thân cây nghệ. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh kém phát triển, có bào tử màu xanh da trời.
+ Ch ng nấm K:
Nguồn gốc phân lập: thân cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh kém phát triển, bào tử có màu xanh vàng xếp thành nhiều vòng tròn đồng tâm, xếp gần nhau.
Hình 3.17: Ch ng nấm K
+ Ch ng nấm L:
Nguồn gốc phân lập: thân cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh bông và dầy. Sợi nấm màu trắng tuyết, có dấu hiệu tiết dịch hoặc đọng nƣớc hình cầu không màu.
Hình 3.18: Ch ng nấm L + Ch ng nấm M:
Nguồn gốc phân lập: thân cây nghệ Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm phát triển chậm, ban đầu có màu trắng rồi chuyển màu vàng xanh. Mặt dƣới nhìn sợi kỵ khí có màu cam.
+ Ch ng nấm Ng1:
Nguồn gốc phân lập: củ nghệ
Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm khí sinh phát triển và có màu trắng. Có sinh bào tử.
Hình 3.20: Ch ng nấm Ng1
+ Ch ng nấm Ng2:
Nguồn gốc phân lập: củ nghệ
Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm kị khí phát triển mạnh màu trắng sữa. Sinh bào tử màu vàng.
Hình 3.21: Ch ng nấm Ng2
+ Ch ng nấm Ng3:
Nguồn gốc phân lập: củ nghệ
Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển: Sợi nấm kị khí phát triển khá mạnh. Không nhìn rõ bào tử.
3.1.3. Kết quả định danh một số chủng nấm nội sinh.
Các chủng nấm đã đƣợc phân lập đƣợc bảo quản trong ống nghiệm và định danh bởi Phòng thí nghiệm Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại Học Quốc gia Hà Nội. Chúng tôi đã xác định đƣợc đến chi của 3 chủng nấm có sinh bào tử và xác định đƣợc tên loài của 1 chủng nấm. Ngoài ra, chúng tôi đang tiến hành xác định tên khoa học đến mức loài cho hai chủng nấm (C, B1) theo phƣơng pháp sinh học phân tử.
Chủng C – Trichoderma sp.
Khuẩn lạc: Trên môi trƣờng MEA khuẩn lạc phát triển nhanh, sau 7 ngày nuôi cấy đạt kích thƣớc 3-4 cm. Khi còn non khuẩn lạc có dạng sợi bông màu trắng, sau khoảng 4 ngày bề mặt khuẩn lạc xuất hiện các đám bao tử màu xanh lục, dạng bột trên bề mặt.
Cơ quan sinh sản: Sợi nấm dinh dƣỡng có vách ngăn, nhẵn, phân nhánh. Cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều lần, không màu, nhẵn. Nhánh mọc càng dài khi càng xa đỉnh, nhánh mọc thẳng đứng với nhánh chính. Thể bình (tế bào sinh bào tử) dạng phialo, mọc thành vòng quanh cuống chính, 2-4 thể bình, thể bình ở đỉnh dài hơn ở vị trí khác, kích thƣớc (5-7,2) × (2-3,8) µm. Bào tử hình trứng ngắn, vách nhẵn, kích thƣớc (3-4,7) × (2,5-3,6) µm.
Chủng B1 –Fusarium sp.
Khuẩn lạc: Trên môi trƣờng MEA khuẩn lạc có màu trắng hơi ngả hồng, dạng sợi bông xốp. Mặt sau khuẩn lạc có màu hồng nhạt.
Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, bào tử trần hình bầu dục, hình quả chuối..., kích thƣớc 2,5 – 4,5 × 6 – 9 (15– 20) µm.
Hình 3.24: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản c a ch ng B1, bar 10 µm
NG01- Fusarium solani
Khuẩn lạc: phát triển nhanh, kích thƣớc đạt 60-80 mm sau 7 ngày trên môi trƣờng PDA, sợi nấm không màu, khuẩn lạc màu trắng, dạng nhung. Mặt trái không màu.
Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, có 2 loại bào tử trần: Bào tử lớn hình quả chuối, hình chiếc thuyền, kích thƣớc 20-25 x 4,5-7 µm. Bào tử nhỏ hình hạt đậu hoặc hình quả thận, kích thƣớc 3-5 x 7-10 µm. Ngoài ra còn có bào tử nghỉ dạng chlamydospore.
Hình 3.25: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản c a ch ng NG01, bar 20 µm
NG03 Fusarium sp.
Khuẩn lạc: phát triển nhanh, kích thƣớc đạt 60-80 mm sau 7 ngày trên môi trƣờng PDA, sợi nấm không màu, khuẩn lạc màu trắng, dạng nhung. Mặt trái không màu.
Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, có 1 loại bào tử trần: Bào tử nhỏ ít, hình hạt đậu hoặc hình quả thận, kích thƣớc 3,5-4,5 x 8-15 µm. Có bào tử nghỉ dạng chlamydospore.
Hình 3.26: Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử c a ch ng NG03, bar 20 µm
3.1.4. Kết quả sinh khối nấm nội sinh:
Chúng tôi tiến hành sinh khối chủng nấm Fusarium sp. (B1) theo phƣơng pháp sinh khối rắn. Sau 5 tuần nuôi cấy thu đƣợc 18 bình tam giác 1 lít, chủng nấm sinh khối nấm trên tổng số 1,8 kg gạo.
Hình 3.27: Kết quả sinh khối ch ng nấm Fusarium sp. (B1) 3.2. Kết quả ngâm chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu nấm nội sinh.
3.2.1. Kết quả ngâm chiết mẫu nấm B1 và C, sinh khối.
Sau khi nuôi cấy sinh khối nấm trong 35 ngày, các sợi nấm đã phát triển kín môi trƣờng gạo sẽ tiến hành diệt nấm bằng tia UV trong box cấy. Nấm sinh khối đƣợc ngâm chiết trong dung môi Ethylacetate đồng thời tiến hành đánh khuấy bằng máy khuấy để phá vỡ các môi trƣờng sinh khối và sợi nấm tăng hiệu suất chiết. Sau khoảng 12h tiến hành chắt lọc dung môi ngâm chiết bằng giấy lọc thu dịch chiết nấm. Quá trình ngâm chiết đƣợc làm 5 lần và cô quay thu đƣợc cặn chiết EtOAc (Ethyl acetate). Cặn chiết EtOAc đƣợc chiết phân lớp với tỷ lệ dung môi MeOH / n-Hexan là 90 / 10 trong phễu chiết. Lắc đều trong khoảng 1h rồi để phân lớp tự nhiên, sau đó mới chắt phần n-Hexan riêng. Phần MeOH tiếp tục đƣợc hòa với n-Hexan với tỷ lệ nhƣ trên và chiết khoảng 3-4 lần thu đƣợc 2 loại: dịch chiết MeOH và dịch chiết n- Hexan. Quy trình ngâm chiết nấm đƣợc mô tả trong sơ đồ 3.1.
Sơ đồ 3.1: Qui trình ngâm chiết mẫu nấm đã sinh khối
Hình 3.28: Ngâm chiết mẫu sinh khối ch ng nấm
Kết quả thu đƣợc khối lƣợng mẫu dịch chiết nhƣ sau: Cặn H2O: 7g
Cặn MeOH: 20g Cặn n-Hexan: 4.5g
3.2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng nấm B.cinera c a các dịch chiết tổng
Các cặn chiết đƣợc tiến hành thử hoạt tính ức chế nấm Botrytis cinera ở nồng độ 1500 ppm dịch chiết tổng. Mỗi mẫu dịch chiết đƣợc cân 45 mg dịch chiết vào ống Eppendorf pha trong 1.5 ml dung môi của từng loại cặn chiết, sau đó tiến hành siêu âm trong 10 phút cho tan hoàn toàn. Nhƣ vậy, các dịch chiết này đƣợc pha vào trong 30 ml ta đƣợc nồng độ dịch chiết trong môi trƣờng thạch là 1500 ppm. Môi trƣờng chứa dịch chiết này đƣợc đổ đều ra 3 đĩa thạch. Hoạt lực ức chế nấm của các dịch chiết nấm đối với sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera đƣợc đánh giá theo công thức sau:
KNƢC % = (C – T) / C x 100 Trong đó:
KNƢC %: Khả năng ức chế của dịch chiết với nấm T: Đƣờng kính tản nấm ở công thức thí nghiệm C: Đƣờng kính tản nấm ở công thức đối chứng âm
Kết quả thử hoạt tính của các cặn chiết đƣợc mô tả trong bảng 3.1:
TT Mẫu Đĩa 1 TB Đĩa 2 TB Đĩa 3 TB Trung bình (mm) Hoạt tính % ĐK1 ĐK2 ĐK1 ĐK2 ĐK1 ĐK2 1 ĐC 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80.00 0.00 2 NB1W 59 59 59 59 59 59 60 60 60 59.33 25.83 3 NB1H 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80.00 0.00 4 NB1M 35 35 35 34 34 34 35 36 35.5 34.83 56.46
Bảng 3.1: Hoạt tính ức chế nấm Botrytis cinera c a các dịch chiết nấm
Nhƣ vậy có thể thấy cặn chiết MeOH từ chủng nấm Fusarium sp. (B1) có khả năng ức chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera gay bệnh thối xám trên rau quả là tƣơng đối cao (56.46%). Cặn chiết nƣớc của chủng nấm này cũng có hoạt tính nhƣng vẫn còn tƣơng đối thấp (25,83 %). Cặn chiết n- Hexan của chúng nấm này không có hoạt tính ức chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera. Nhƣ vậy, chủng nấm Fusarium sp. (B1) chứa các chất có
hoạt tính ức chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera trong cặn chiết MeOH, các chất hòa tan trong dung môi n-Hexan không có hoạt tính ức chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera.
Hình 3.29: Hình ảnh thử hoạt tính ức chế sự phát triển ch ng nấm
Botrytis cinera c a các cặn chiết. 3.2.3. Kết quả phân lập chất từ nấm Fusarium sp. (B1).
Cặn chiết MeOH đƣợc phân tách trên cột hấp phụ silica gel với hệ dung môi n-Hexan:Aceton (từ 1:0 đến 0:1) thu đƣợc 11 phân đoạn. Phân đoạn số 4 chứa nhiều dầu nên đƣợc chạy GC-MS và thu đƣợc công thức hóa học của 12 loại acid ký hiệu các chất 1-12. Phân đoạn số 6 tiếp tục đƣợc phân tách trên cột silica gel với hệ dung môi n-Hexan:ethyl acetate (từ 1:0 đến 0:1) thu đƣợc